人类世生物多样性丧失的危机要求我们开发用于研究非模式生物的新工具。例如，大象既是濒危物种，也是研究体型、社会行为和寿命等复杂表型的优良模型，但它们仍然严重缺乏研究。本文在此报告首次获得大象（
在过去的1万年中，人类对世界生态系统产生了深远影响。人类几乎彻底改变了世界上每一种生态系统的生态格局，并且很可能至少对全球超过三分之二陆生巨型动物群的灭绝负有部分责任[
直到过去十年，这些努力中的大多数仍具有操作性，但近年来，多个研究团队已开始考虑将生物技术作为一种保护工具[
这些保护与“灭绝复活”工作流程的一个关键组成部分是诱导多能干细胞（iPSCs）的生成。iPSCs在分子和表型特征上与胚胎干细胞（ESCs）相似，并且原则上可以被转化为生物体内任何其他类型的细胞——包括“灭绝复活”和保护所需的胚胎细胞。iPSCs最初是由小鼠的体细胞获得的[
一旦获得每个物种的iPSCs，人们便能够开启理解其生物学并通过工程手段促进其存续或重生的大门。近年来，干细胞生物学家已经利用干细胞进行细胞命运工程，将其分化为多种不同类型的细胞，用于治疗或诊断目的[
除其生态相关性之外，大象还具有非常有趣的生物学能力——它们高度聪明[
在对更为传统的重编程方法进行全面筛选但未获成功之后，研究人员通过采用基于化学的小分子多能性培养基并结合克隆挑选扩增，随后过表达关键多能性转录因子OSKM(LN)和癌基因SV40LT，和/或使用针对大象
除了依赖转基因的方法之外，我们还探索了一组日益发展的、无需使用转基因的化学重编程方法。我们测试了一组已发表的鸡尾酒配方[
正是通过整合这两类方法，才实现了首次生成
在建立起更为典型的干细胞形态之后，我们进一步开展了全面的干细胞表征。我们通过免疫荧光（IF）证明，我们的细胞表达核心多能性蛋白（
尽管我们成功地对我们的emiPSCs开展了大量分子和功能检测，但有趣的是，我们并未观察到
在确立了对内源性表达的增强之后
我们的 emiPSC 表达多种幼稚态多能性标志物，并且能够通过胚样体分化和畸胎瘤形成分化为三个胚层。在确认核心多能性标志物的表达后，我们希望评估这些细胞的基本生长特性和染色体正常性。为此，我们采用了简单的细胞核分离、裂解和染色体计数方法，以确认我们的细胞确实具有预期的染色体数目 56/56（
接下来，我们希望检测经典上在预备态与幼稚态 iPSC 中表达的基因的表达情况，并确定我们的细胞更接近预备态还是幼稚态。我们观察到，与其他物种中的幼稚态细胞更常相关的形态特征在我们的细胞中有所体现，并且几乎未观察到自发分化（
由于我们的 emiPSC 细胞系表现出符合预期的干细胞分子和表型特征以及正常核型，因此我们进一步探究其分化潜能。首先，我们进行了胚样体（EB）形成实验。我们证明，所有细胞系均可在 5–7 天内形成 EB，且其中包含表达来自三个胚层各自早期分化标志物的细胞—
在确认 EB 中存在许多预期的早期分化标志物后，我们进行了三胚层分化实验，以验证各自谱系中标志基因的存在。我们观察到，与其来源的 emiPSC 细胞系和 emEC 相比，这些分化细胞中的早期分化标志物通过 RNA-seq 表现出上调（
鉴于我们的 iPSC 细胞系能够形成 EB 并分化为早期三个胚层，我们进一步测试了这些细胞系是否能够形成畸胎瘤。尽管该实验可能存在混杂因素，并且其是否出现在数据集中往往取决于研究人员，这很可能是因为该实验通常难以标准化[
在建立我们的 iPSC 细胞系并确认其分化能力后，我们对其与一组来源广泛的其他哺乳动物干细胞进行了比较分析[
对多个物种的 RNA-seq 数据进行了比较。
在这里，我们展示了首个有文献记载的、成功生成大象诱导多能干细胞的方案。我们的方案需要复杂的化学培养基配方以实现原代细胞的部分重编程，并需要大象特异性的核心多能性因子以及对细胞生长通路的调控来实现完全重编程。此外，我们还验证了 emiPSC 的核型完整性，测定了其较高的生长速率和可忽略不计的自发分化率，并确定这些细胞显著上调了许多幼稚态多能性标志物以及部分经典预备态标志物。
随后，我们对这些 emiPSC 系进行了功能表征，并证明其能够形成胚样体（EBs）并分化为三个胚层。目前，正在开展进一步的 EB 免疫染色工作，以解析 EB 的三维结构（即二维成像切片），并结合更多标志物进行分析。对于三胚层分化细胞的免疫荧光（IF）结果，现有成像、RNA 测序（RNA-seq）和实时定量逆转录 PCR（RT-qPCR）数据均证实，在这些实验中存在早期分化标志物。随后，我们进一步表明，这些细胞系也能够形成包含多样细胞类型群体的畸胎瘤，提示其具有分化潜能。
鉴于畸胎瘤在体内的生长动态存在差异（甚至可长达 12 周），我们正在通过独立注射和更长期监测，并随后收集样本进行分析，以进一步验证其分化潜能。有趣的是，裸鼹鼠具有抗癌特征，并且与大象共享某些细胞周期调控异常（上调
本研究首次成功报道了 emiPSC 的制备，并标志着后续更多研究工作的开始。进一步分析……的意义
重编程持续时间方面，鼠等模式生物通常为 5–10 天，包括人类在内的大型哺乳动物通常超过 3 周，而亚洲象则更长，达到 2 个月。我们正在进一步探索，是否可通过替代策略缓解本研究中观察到的较长重编程过程。例如，在关于裸鼹鼠 iPSC 建立的研究中［
对一组多样化哺乳动物 iPSC 的比较分析显示，我们的细胞似乎与其他大型体型哺乳动物聚类最为接近。然而，不同物种间在多能性标志物表达和分化潜能方面观察到的差异，值得进一步深入研究，以明确这些现象究竟源于重编程方法还是物种差异。例如，最初相对较低表达的
出于保护目的和配子发生研究的需要，验证真正的初始态（naïve）iPSC 是关键一步。探索象干细胞所具有的、为大象所特有的特征，以及赋予细胞来源胚胎发育模型……的能力
生物样本库建设中的要求，例如新近分离获得的细胞以及亲本细胞谱系的选择，也可预测重编程的成功结果，从而进一步夯实保护流程的基础。在本研究之后，进一步从长鼻目现存所有物种和亚种中建立 iPSC，对于其保护以及理解这些标志性巨型食草动物之间的相似性与差异性至关重要。
RNA 提取使用 RNeasy Plus Universal Mini Kit（Qiagen 73404）进行。RNA 制备完成后，RNA 样本直接送至 NovoGene 进行外部质量控制（QC）和样本测序。对于 ATAC-seq 样本，将冷冻细胞沉淀送至 NovoGene，所有实验、文库制备和测序均由 NovoGene 完成。
RNA-seq分析使用Form Bio平台上的RNASeq工作流中的表达分析模块进行。首先使用TrimGalore对测序读段进行修剪，以去除低质量（qual < 25）的读段末端，并去除长度小于35 bp的读段。修剪后的读段使用STAR2（默认）或HiSAT比对至参考基因组。对于同一样本由多次运行生成的BAM文件，使用Samtools进行合并。转录本和基因的丰度分别使用FeatureCount生成原始基因计数，使用StringTie生成FPKM，使用Salmon生成原始转录本计数。
样本间比较以及基因/转录本差异表达分析使用EdgeR、DESeq2和IsoformSwitchAnalyzeR进行。ATAC-seq分析采用类似的工作流程。具体而言，首先使用TrimGalore对读段进行修剪，以去除低质量（qual < 25）的读段末端，并去除长度小于35 bp的读段。该工作流程可使用原生开源工具（NOST）或Parabricks运行。采用NOST时，修剪后的读段使用BWA mem或Minimap2比对至参考基因组。
对于同一样本由多次运行生成的BAM文件，使用Samtools进行合并。比对质量使用FastQC、Samtools和Bedtools进行评估。采用Parabricks时，使用fq2bam对修剪后的读段进行比对、标记重复读段并评估比对质量。质量指标使用MultiQC进行汇总。MA图使用DESeq2（v3.18）和ggpubr（v0.6.0）生成。
人类、狨猴、小鼠、兔、牛和犀牛的公开RNA-seq数据[
EB采用4% v/v多聚甲醛（15710，Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA，USA）固定20 min，清洗3次后，用0.5% Triton X-100（Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO）透化20 min。样本再清洗3次后，使用5% BSA、0.05% Triton封闭1 h，并于4°C下在含1% BSA、0.05% Triton-X100的抗体稀释液中与一抗孵育过夜。
样本清洗3次后，于37°C下与二抗孵育1 h，随后清洗3次，并在室温下用Hoechst 33342（H1399，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）复染10 min，再清洗3次并使用Vectashield（Vector Labs.，H100010A）封片。显微图像使用Zeiss AxioObserver .5 LED荧光显微镜、高性能显微成像相机Axiocam 705 mono R2采集，物镜为LD A-Plan 10X/0.25 Ph1。
emiPSC使用定制的大象特异性抗体进行染色，用于
胚样体（EBs）采用 AggreWell 400 板（StemCell 34450）或超低吸附 96 孔板（Corning 4515）形成。平板预先用 Anti-Adherence Rinsing Solution 进行预处理，随后加入上述重编程培养基中的细胞：对于 AggreWell 400，每个微孔约加入 400 个细胞；对于 96 孔板，每孔加入 5k 个细胞，并以 100g 离心 3 min。接种后的细胞在 37C、5% CO2 和 95% 湿度条件下静置培养 24 h。
24 h 后，在不扰动细胞的情况下，每 48 h 更换一次培养基，使用 AggreWell EB Formation Medium（StemCell 05893）或重编程培养基，随后进行 IF 和成像。
将 50,000 个 emiPSC 接种于经 Laminin521 包被的 12 孔板上，并使用 STEMdiff Trilineage Differentiation Kit（StemCell 05230）处理 10 天。
染色体分离和计数通过将细胞在 37C 下孵育 3 h 进行。随后，将细胞重悬于 37C 的 0.075M KCl 溶液中 8 min。接着，将细胞重悬于 1 ml 固定液中，轻轻混匀，并在室温（RT）下孵育 10 min。随后以 900 rpm 离心 8 min，并将细胞重悬于固定液中，在 RT 下孵育 10 min。该固定步骤重复两次。最后，将细胞加染料后装载于载玻片上进行成像。
将 200,000–1,000,000 个 emiPSC 注射至免疫缺陷小鼠后肢。连续 6 周每日观察腿部情况，之后取出肿瘤团块。畸胎瘤切片由 Histowiz 的专业组织学家进行评估。
概念设计，E.H.；方法学，E.H. 和 E.A.；正式分析，E.A.、K.H.、C.R.C.、Y.T.、K.B.、C.R.I.、N.K.、H.B.、X.A.P.、J.N.s、A.K.、B.C. 和 E.H.；研究实施，E.A.、K.H.、C.R.C.、Y.T.、A.A.T.、K.B.、C.R.I.、N.K.、H.B.、X.A.P.、A.Q.、G.R.、G.K.、M.M.、N.M.、K.Z.、J.K.、A.B.、B.M. 和 E.H.；资源提供，B.L. 和 G.C.；数据整理，E.A.、Y.T.、K.B. 和 C.R.I.；写作，E.A. 和 E.H.；可视化，E.A. 和 E.H.；监督指导，E.A.、B.C.、B.L.、G.C. 和 E.H.；项目管理，E.A. 和 E.H.；经费获取，B.L. 和 G.C.。
E.H.、K.H.、C.R.C.、B.L. 和 E.A. 是关于象 iPSC 使用的专利及专利申请的发明人，该等专利由 Colossal Biosciences 持有。E.H.、K.H.、C.R.C.、C.R.I.、N.K.、H.B.、X.A.P.、G.R.、G.K.、M.M.、N.M.、K.Z、J.K.、A.B.、B.M.、B.C.、M.J.、B.L.、G.C. 和 E.A. 为 Colossal Biosciences 的股东。
E.A.、C.R.C.、K.B.、X.A.P.、B.M.、A.K.、A.B.、B.M.、B.C.、M.J.、B.L.、G.C. 和 E.H. 为 FormBio 的股东。Y.T. 与 Colossal Biosciences 签有涉及现金/股票的咨询协议。G.C. 是 Colossal Biosciences 及其他公司的创始人和股东——有关 G.C. 的完整利益披露见于
作者谨此感谢 Beth Shapiro 对本稿提出的宝贵意见，并感谢 Colossal Biosciences 科学顾问委员会、保护顾问委员会、执行顾问委员会以及核心执行领导团队成员在本项工作中所开展的交流与提供的支持。我们同时感谢 Colossal 的全球学术与产业合作伙伴。我们感谢 BioRender 提供可视化支持，并感谢 AbClonal 进行定制抗体设计。
补充添加了额外的补充数据，并对正文中的部分表述进行了修改。
感谢您有兴趣帮助传播 bioRxiv 的相关信息。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.05.583606
🏷️ 诱导多能干细胞 大象 干细胞建立 濒危物种保护 非模式生物