分子生物学
由于其紧凑的RNA支架、富含T的PAM需求以及更高的靶标特异性，CRISPR-Cas12a核酸酶为Cas9提供了一种颇具吸引力的替代方案。然而，调控不同Cas12a同源体活性与辨别能力的机制特征仍未得到充分理解。在本研究中，我们结合冷冻电子显微镜、突变分析和动力学建模，对通过宏基因组挖掘鉴定出的高活性、高特异性核酸酶Cas12a-MG29-1进行了表征。Cas12a-MG29-1的结构揭示，在R环远端附近的柔性环发生了重新定位，其中一个环区的结合减弱，而第二个远端环则形成了额外接触。
基于结构指导的突变和环交换实验表明，远端R环结构以依赖具体背景的方式调控靶标辨别。单周转切割和停流测量显示，Cas12a-MG29-1与AsCas12a以相似的动力学形成可逆R环，但二者在R环形成后的链切割步骤上存在差异。全局动力学建模表明，Cas12a-MG29-1表现出加速的非靶链切割，从而使动力学分配偏向于产物形成。上述更快的不可逆催化承诺为其在不改变初始靶标识别的情况下提升活性和特异性提供了机制解释。
综上，这些发现确定了远端R环相互作用和催化承诺是决定Cas12a功能的关键因素，并为解析和工程化下一代Cas12a同源体提供了理论框架。
本研究的部分内容与PCT专利申请PCT/US2021/021259相关。D.W.T.曾与Metagenomi Therapeutics, Inc.签署资助研究协议。其余作者声明不存在竞争性利益。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.05.13.724879v1?rss=1
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