对培养胚胎的研究为认识人类围植入期发育提供了重要见解。然而，关于围植入期谱系发育及其潜在机制的详细认知仍然不清楚。在本研究中，我们利用三维培养的人类胚胎，报道了早期植入后谱系的完整细胞图谱，并解析了上胚层及下胚层衍生谱系的细胞组成和基因特征。此外，我们通过组装初始态人胚胎干细胞（naive hESCs）和胚外细胞，构建了一种类胚组装体（E-assembloid）。利用人类胚胎和E-assembloid，我们揭示了WNT、BMP和Nodal信号通路以协同但功能各异的方式调控人类围植入期谱系发育。
特别地，我们解析了胚外中胚层和胚外内胚层命运决定的潜在机制。最后，我们进一步开发了改良的E-assembloid，以重现原肠形成前人类胚胎中的上胚层和下胚层发育及组织结构。我们的研究结果为理解人类围植入期发育提供了新的见解，而E-assembloid则为解析驱动人类胚胎发生的细胞行为和信号互作提供了有用模型。
在人类中，囊胚是一个由约200个细胞组成的中空球状结构，在胚胎发育第6至7天（E6-7）植入子宫壁，从而启动植入后发育。在晚期囊胚中，内细胞团（ICM）分化为下胚层（HB）和上胚层（EPI）：下胚层形成卵黄囊，而上胚层进一步分化为三种确定性胚层，构成胚体本身。尽管这两种谱系在人类发育中具有关键作用，但我们对于HB和EPI谱系植入后发育的认识仍然非常有限。近年来，我们及其他研究者已成功开发出
利用人类胚胎研究围植入期发育面临诸多伦理问题，同时也受到技术障碍的限制，例如特定谱系中的遗传操作以及胚胎发育的可重复性
为填补人类围植入期发育知识空白，在本研究中，我们利用三维培养的人类囊胚提供了早期植入后胚胎谱系的完整细胞图谱。此外，我们成功构建了一种人类类胚组装体（E-assembloid），其重现了人类围植入期胚胎的发育里程碑、三维细胞组织结构和谱系组成，从而建立了一种用于研究人类早期植入后发育的新型胚胎模型。利用人类胚胎和E-assembloid，我们的研究揭示了HB和EPI衍生谱系的转录状态，以及WNT、BMP和Nodal信号通路在介导其谱系决定中的功能作用。
尽管围植入期人类胚胎中的一些细胞类型近期已得到表征
单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据来自10x Genomics平台。
随后，我们分析了这些谱系的基因表达特征，并鉴定出有助于区分着床前后人类发育过程中不同细胞类型的分子标志物。正如预期，PostE−EPI 和 PostL−EPI 均表达核心多能性基因。
我们进一步对 E13 人胚胎进行了免疫染色，并证实 XEN 细胞对 GATA6、SOX17、FOXA1、PODXL1、N-Cadherin 和 OTX2 呈阳性，而 ExM 细胞对 GATA6、KDR、SNAIL 和 COL3A1 呈阳性，但对 SOX17、FOXA1、PODXL1、OTX2 或多能性标志物呈阴性（补充信息，图 S1f，g），这与 scRNA-seq 数据一致（
我们还进行了 KEGG 通路分析，以揭示参与谱系发育的信号通路。AME、PS、ExM、VE/YE 和 AVE 簇富集了与 BMP 和 WNT 信号通路相关的基因（
为了模拟着床后 HB 和 EPI 谱系发育，我们尝试使用 naive hPSCs 建立一种胚样体，这些细胞是
随后，我们尝试将 AIC-N hESCs 与人滋养层干细胞（hTSCs）进行聚集
WNT 和 BMP 信号通路在人类早期胚胎发育中发挥关键作用
接下来，我们检测了 E-assembloids 的发育潜能。在 M1 条件下，包埋于 Matrigel 液滴中的 E-assembloids 体积逐渐增大（
与 E-assembloids 相比，大多数在 M1 条件下单独培养的 AIC-N hESC 细胞团即使在 D9 仍维持多能性（补充信息，图 S4k，l），这表明存在来自 SNCs 的诱导信号以驱动 E-assembloid 的发育。由于 SNCs 表达 WNT 和 BMP 配体（补充信息，图 S4c），且 ExM、PS 和羊膜的命运决定与 WNT 和 BMP 信号密切相关
即使在调控 WNT 和 BMP 信号并延长培养时间的条件下，E-assembloids 和 AIC-N hESC 细胞团仍未产生 XENLCs（
基于胚内和胚外谱系命运决定涉及 WNT、BMP 和 Nodal 信号通路的原理（
在 D8 时，超过 90% 的 E-assembloids 含有两个扩增的腔室，即卵黄囊样结构和羊膜腔样结构，其周围被 ExMLCs 包围（
为了进一步表征 D8 的 E-assembloids，我们对三维培养的人胚胎与 D8 E-assembloids 的整合 scRNA-seq 数据进行了比较转录组分析（补充信息，图 S7a）。
UMAP 图及滋养层和羊膜标志基因的差异表达显示，SNC 与 TrB 群体之间存在明显差异（补充信息，图 S7a，b），但人胚胎与 E-assembloids 中 HB 和 EPI 相关谱系的组成相似，包括 postE-EPI、postL-EPI、UC、AME2、PS1/2、ExM1/2、VE/YE 和 AVE（
在本研究中，我们提供了一个完整的着床前后胚胎谱系细胞图谱，并鉴定了 XEN 和 ExM 标志物。我们的数据可作为有用资源，用于评估人胚胎模型以及胚内/胚外谱系。
利用3D培养的人类胚胎和E-assembloid，以及AIC-N hESCs的2D和3D分化体系，我们系统性解析了WNT、BMP和Nodal信号通路对PS、AME、ExM和XEN命运决定的作用，并阐明了XEN和ExM命运决定的潜在机制（
我们的研究存在若干局限性。首先，影响胚外细胞（xEMs）包裹naive hESC细胞团能力的机制尚未揭示。既往研究提出，组织形态发生过程中稳健的模式形成源于基于由形态发生素指导的梯度所指示的组合性黏附编码的细胞自组织
总之，本研究为推进人类胚胎学与生殖学认知提供了重要信息，而E-assembloid为未来探索人类围植入期发育过程中的谱系多样化、信号相互作用和组织图式形成提供了有用模型。
T.L.和W.J.发起了该项目。T.L.监督了整个项目。T.L.和Z.A.设计了实验并撰写了手稿。T.L.指导Z.A.、Y.Y.、K.D.和B.N.开展数据分析。Z.A.、B.N.、Y.Y.、S.W.、Y.H.、C.Z.、C.Z.、R.K.、T.C.、W.L.、N.L.和S.Z.进行了干细胞分离与培养、类胚体组装与鉴定、培养体系开发以及机制研究。L.X.、G.S.、L.R.、X.M.、Y.L.和Z.W.进行了人类胚胎培养。Y.Y.、Z.A.、K.D.、Y.G.和W.L.分析了测序数据。
Y.Z.和J.F.参与了测序数据分析和手稿准备工作。
作者声明不存在竞争性利益。
关于人类胚胎以及从人类囊胚建立新干细胞系的研究是我们既往工作的延续
为控制囊胚的变异性，我们在使用前对胚胎质量进行了评估。根据Gardner评分系统
在本研究中，根据先前建立的两项标准，选择3D培养的人类胚胎进行10x测序：1）在培养过程中出现明显扩张；2）无明显细胞死亡或碎裂表型
囊胚被接种于经丝裂霉素C（Sigma，M0503）灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（Millipore，PMEF-CFL）饲养层细胞（以下简称 feeders）上。48小时后，在已贴壁的胚胎中可见类 hESC 外生长物，并将其机械转移至 50% TrypLE（Thermo Fisher Scientific，12605-028）中，于 37℃孵育 10–15 分钟。或者，如果类 hESC 外生长物不可见，则将整个贴壁胚胎用 50% TrypLE 于 37℃孵育 10–15 分钟。
随后，将消化后的类 hESC 外生长物（或整个胚胎）转移至一滴 AIC-N 培养基中，并用精细拉制的巴斯德吸管轻柔上下吹打，使其解离为单细胞。所有解离得到的单细胞均分散接种至 feeders 上。3–5 天后，可观察到一些明显的 naïve hESC 集落，并进一步采用 50% TrypLE 将其解离为单细胞进行传代。常规情况下，AIC-N 培养基每 2 天更换一次，新建立的 AIC-N hESC 细胞系每 3–4 天按 1:5–1:10 的比例传代一次。
在 AIC-N hESC 的建系与维持过程中，AIC-N 培养基中补充 10 μM Y27632（Selleck，S1049）。本研究中，AIC-N hESC 已在稳定的 naïve 状态下维持超过 50 代。
AIC-N 培养基由改良的 N2B27 培养基组成，并补充 10 ng/ml Activin-A（Peprotech，120-14E）、2 μM IWP2、0.3 μM CHIR99021（Selleck，S2924）、1 μM PD0325901（Selleck，S1036）、2 μM Gö6983（TOCRIS，2285）以及 10 ng/ml 重组人 LIF（Peprotech，300-05）。
500 ml 改良 N2B27 培养基由以下成分组成：240 ml DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific，10565-018）、240 ml Neurobasal（Thermo Fisher Scientific，21103-049）、5 ml N2 supplement（Thermo Fisher Scientific，17502-048）、10 ml B27 supplement（Thermo Fisher Scientific，17504-044）、0.5% GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，35050-061）、1% 非必需氨基酸（NEAA，Thermo Fisher Scientific，11140-050）、0.1 mM β-巯基乙醇（Sigma，M7522）、0.38 ml 7.5% BSA（Sigma，A1933）、50 μg/ml L-抗坏血酸 2-磷酸酯（Sigma，A8960）、0.5 ml 化学成分限定脂质浓缩液（Thermo Fisher Scientific，11905-031）、12.5 μg/ml 胰岛素（Roche，11376497001）、1.25 ml 丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，11360-070）、0.02 μg/ml 孕酮（Sigma，P8783）。
采用常规条件培养的 primed hPSCs（CC-hPSCs，KSR/bFGF 培养基）经 50% TrypLE 消化为单细胞，并以 3×10 的密度接种
为重置人 CC-hPSCs，将单个 CC-hPSCs 以 8×10 的密度接种
囊胚来源 hTSC 细胞系的建立与培养按照已发表的方法进行
nTEs（naïve hESC 来源的滋养外胚层样细胞）的分化按照先前已发表的方法进行
hTSCs 的分化按照所述方法进行
AIC-N hESC 来源 hTSCs 向 STBs（合体滋养层细胞；2D 和 3D）及 EVTs（绒毛外细胞滋养层细胞）分化的方法按照先前报道的方法进行
在Matrigel包被的培养皿/培养板上生长的AIC-hPSCs按照前述方法在AIC培养基中进行培养。
为生成BMP4诱导细胞（BICs），采用50% TrypLE将AIC-hPSCs消化为单细胞，并以1×10的密度接种。
BICs向成熟滋养层细胞的分化按照已发表的方法进行。
对于WNT、BMP和Nodal信号在XENLCs和ExMLCs命运决定中的功能实验，将AIC-N hESCs以1500/孔-96孔板的密度接种于饲养层上，并置于所示分化条件下培养（
经预验证的靶向第3外显子的gRNA序列为
畸胎瘤实验按照NIH指南和动物操作规范进行，并经云南省灵长类生物医学研究重点实验室动物护理与使用委员会预先批准。约10
细胞在传代前一天用于进行核型分析。以新鲜培养基孵育2–4小时后，采用Colcemid溶液（BI，12-004-1D）处理细胞，终浓度为0.02 μg/ml，处理1小时。随后用PBS清洗细胞两次，消化为单细胞并离心。接着，将细胞沉淀重悬于5 ml低渗溶液（0.075 M KCl）中，于37℃放置15分钟。向低渗悬液中逐滴加入1 mL冰冷固定液（甲醇:乙酸 = 3:1），并于室温放置5分钟。离心并弃去上清后，向悬液中逐滴加入5 ml冰冷固定液，于室温放置30分钟后再次离心。固定步骤重复三次。
最后，将细胞沉淀重悬于终体积为3 ml的冰冷固定液中，并置于–40℃冰箱中保存。后续G显带核型分析在中国昆明云南省第一人民医院进行。每次分析至少计数20个中期分裂相。
类囊胚形成按照先前描述的方案进行。
将AIC-N hESC集落暴露于1 mg/ml IV型胶原酶中60–90分钟，使其从饲养层上脱离。收集脱离的集落，采用50% TrypLE将其解离为单细胞，经20 μm细胞滤网过滤后，以1000 rpm离心4分钟使其沉淀，随后重悬于AIC-N培养基中，并使用血细胞计数板进行计数。按照制造商说明书准备AggreWell™ 400 24孔板。取500 μl细胞悬液（包括3×10
将人E-assembloid从微孔中转移至预冷并置于冰上的1.5 mL微量离心管中。约10 min后，吸除上清，加入冰冷的M1与Matrigel（Corning, 354230）按1:2配制的混合物重悬沉淀，使终浓度达到600个E-assembloid/mL。
充分混匀后（为确保E-assembloid在悬液中均匀分布，每个1.5 mL微量离心管中的悬液体积不超过300 μL，并在滴加至3.5 cm培养皿的过程中充分混匀），将10–20 μL/滴的E-assembloid悬液接种于3.5 cm培养皿中（每皿约20滴），迅速将培养皿倒置以防止E-assembloid沉降至液滴底部，在37℃下凝固20 min后，每皿覆盖2 mL预温的M1培养基。
在整个包埋过程中，Matrigel、培养基和离心管始终置于冰上；所有用于人E-assembloid包埋和培养的培养基均补充10 μM Y27632。除非另有说明，常规每两天更换一次培养基。对于人E-assembloid的延长培养，在指定时间范围内，基于M1条件进行IWP2/LDN添加以及CHIR/A83-01/SB431542撤除，并建立了两种E-assembloid组装与延长培养方案（
AIC-N hESC团块按“人胚样体生成”部分所述方法制备。在团块形成后，大部分AIC-N培养基被移除，并向每孔Aggrewell中轻柔加入2 mL指定培养基。在16–20 h内，将这些AIC-N hESC团块从微孔中转移出来，并按上述“3D包埋”培养方法进行培养。简言之，将这些AIC-N hESC团块转移至预冷并置于冰上的1.5 mL微量离心管中。约10 min后，吸除上清，加入冰冷的指定培养基与Matrigel按1:2配制的混合物重悬沉淀，使终浓度达到1000个团块/mL。
将10–20 μL/滴的AIC-N hESC团块悬液接种于3.5 cm培养皿中（每皿约20滴），在37℃下凝固20 min后，每皿覆盖2 mL预温培养基。在整个包埋过程中，Matrigel、培养基和离心管始终置于冰上；所有用于AIC-N hESC团块包埋和培养的培养基均补充10 μM Y27632。除非另有说明，常规每两天更换一次培养基。在延长培养期间，AIC-N hESC团块在M1条件下单独培养至不同时间点（补充信息，图S4k）。
对于WNT和BMP信号通路的功能实验，根据指定组合，在不含CHIR99021的M1培养基中加入CHIR99021（3 μM）、BMP4（20 ng/mL）、LDN（200 nM）和IWP2（2 μM）（
AIC-N hESC细胞团按照“人类胚样体的构建”部分所述方法制备。接种后24 h，将这些已形成的AIC-N hESC细胞团从微孔中转移出来，并按照上述“3D包埋”培养方法，在所示条件下培养6天（补充信息，图S6j）。基础培养基由添加10 μM Y27632的改良N2B27培养基组成。为诱导WNT和BMP信号通路，在延长培养的前12 h内，使用CHIR99021（2 μM）和BMP4（1 ng/ml）处理AIC-N hESC细胞团（补充信息，图S6j）。
在本研究中，我们通常使用传代20–40代的AIC-N hESCs构建胚样体，且未观察到由传代次数引起的明显差异。除非另有说明，细胞或胚样体培养实验均在21% O
为通过流式细胞术检测细胞表面标志物，将AIC-N hESC克隆经1 mg/ml IV型胶原酶处理60–90 min后从饲养层上分离，收集脱落的克隆，并用50% TrypLE将其消化为单细胞，随后离心，并用含1% FBS（BI，04-001-1A）的预冷PBS清洗。
对于Tra-1-85的流式细胞术分析，细胞在4℃条件下与用含1% BSA的PBS稀释的抗Tra-1-85抗体（Abcam，ab108308，1:100）孵育30 min，随后再用AlexaFluor 555偶联的驴抗兔IgG二抗（Thermo Fisher Scientific，A-31572，1:1000）染色30 min。
对于Tra-1-60和SUSD2，细胞在4℃条件下分别与用含1% BSA的PBS稀释的PE偶联抗Tra-1-60抗体（Thermo Fisher Scientific，12-8863-82，1:5）或PE偶联抗SUSD2抗体（Biolegend，327406，1:100）孵育30 min。
相应地，分别使用正常兔IgG（Abcam，ab172730，1:100）、PE偶联小鼠IgM（Thermo Fisher Scientific，MGM04，1:10）和PE偶联小鼠IgG1抗体（BD Pharmingen，554680，1:100）作为同型对照。流式细胞术使用FACSAria III进行，数据采用FlowJo软件分析。
本研究中所有贴壁生长的细胞均在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定20 min，并用PBS清洗3次。对于D1时期的胚样体（Aggrewell中的聚集体），将聚集体从微孔中转移至预冷并置于冰上的1.5 mL微量离心管中。约10 min后，吸去上清，将聚集体重悬并在4□°C下用4% PFA固定3 h。对于“3D包埋”培养，胚样体或hESC球体在4□°C下用4% PFA固定3 h，随后转移至1.5 mL微量离心管中。
所有结构（胚样体或hESC球体）均用PBS清洗3次，在含20%蔗糖的PBS中于4□过夜脱水，包埋于O.C.T.（Sakura Finetek，4583）中，并使用Leica冷冻切片机切成厚度为10 μm的切片。经室温下用含0.2% Triton X-100、100 mM甘氨酸和3% BSA的PBS透化并封闭60 min后，将细胞或切片与一抗在4□°C下孵育过夜，再用含0.05% Tween-20的PBS清洗3次，于室温下与二抗孵育2 h，并再次用含0.05% Tween-20的PBS清洗3次。
DAPI（Roche Life Science，10236276001）用于细胞核染色。图像由Leica SP8激光共聚焦显微镜采集。所用抗体列于
为评估被xEMs（hTSCs或nTEs或BICs/SNCs）包裹的AIC-N hESC细胞团的效率，对胚样体冷冻切片分别进行OCT4和CK7染色，以分别标记AIC-N hESCs和xEMs。根据谱系标志物的表达模式，这些结构被分为三种类型（
为定量不同类型细胞或胚样体的比例，以及胚样体中特定细胞类型的数量，对2D细胞培养物和不同类型胚样体的冷冻切片使用所示标志物进行染色。随后使用共聚焦显微镜（Leica SP8）手动统计不同类型细胞或胚样体的百分比，以及胚样体中特定细胞类型的数量。统计分析和作图使用GraphPad Prism 9完成。
为测量发育中E-assembloids的直径，将不同时间点的E-assembloids用4% PFA固定，在Matrigel去聚合后使用相差显微镜随机拍照。使用Image J软件处理图像并测量E-assembloids的直径。统计分析和作图使用GraphPad Prism 9完成。
贴壁生长的细胞（在 Matrigel 上培养的 BICs 和在 Col IV 上培养的 hTSCs）通过使用 50% TrypLE 消化为单细胞后收集。对于 AIC-N hESCs 以及在饲养层上培养的 hTSCs，通过用 IV 型胶原酶处理 60–90 min 使克隆从饲养层上脱离，并收集脱离的克隆。对于包埋于 Matrigel 液滴中的分化 AIC-N hESC 细胞团，将培养物在 4□ 条件下用 Cell Recovery Solution（Corning，354253）处理 1 h。
待 Matrigel 去聚合后，收集分化的 AIC-N hESC 细胞团。所有培养物均用 PBS 清洗两次。采用 TRIzol™ Reagent（Thermo Fisher Scientific，15596018）提取 AIC-N hESCs、hTSCs、BICs 及分化 AIC-N hESC 细胞团的总 RNA。2×150 bp 双端文库使用 Illumina HiSeq X Ten 仪器进行测序。文库构建和测序由 Annoroad Gene Technology 完成（
人滋养层细胞之间的相关性分析
双端测序在 HiSeq X Ten 平台（Illumina）上进行。文库构建和测序由 Annoroad Gene Technology 完成（
使用 FastQC（v0.11.8）（对双端 150 bp 原始 reads 的测序质量进行了检测
基于我们先前的工作和其他报道，对 3D 培养人胚胎的单细胞解离进行了优化
进一步分析使用 Seurat 软件包（v 4.0.3）进行
对于来自 E-assembloids 的 10x Genomics 数据，
按照已发表的方法，对 3D 培养人胚胎和 E-assembloids 的细胞间通讯网络进行了分析
统计检验在 GraphPad Prism 9 软件和 Microsoft Office Excel 2019 中进行。在进行每项参数统计检验之前，均对数据的正态分布和方差齐性进行了检验。在适当情况下，
本研究获得了国家重点研发计划（2022YFA1103100 和 2021YFA0805700）、国家自然科学基金（32130034、82192874 和 82160294）、国家重点研发计划（2020YFA0112700）、云南省科技重大基础研究项目（202102AA100007、202001BC070001 和 2019FY002）、云南省科学技术厅—昆明医科大学联合专项资金（202101AY070001-260 和 202301AY070001-298）的资助。
我们感谢 Yan Bi 分享 ALPPL2 抗体。我们感谢 Ran Yang 提供有关人胚胎单细胞解离和制备的详细信息。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.15.545180
🏷️ 人类胚胎发育 着床期 类胚组装体 谱系分化 WNT/BMP/Nodal信号