弥合胚胎发生研究中的鸿沟：源自北婆罗洲猩猩的类囊胚作为人类发育模型
Nicole Tay、Qiuye Bao、Uma Kamaraj、Ying Ying Zeng、Ka Wai Wong 及另外11位作者
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https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-8154543/v1
本作品采用 CC BY 4.0 许可协议授权。
对灵长类早期胚胎发生的理解仍然受到伦理和技术限制的制约。为应对这一问题，我们建立了一种基于干细胞的胚胎模型，来源于北婆罗洲猩猩（
人类胚胎发育是一个复杂且动态的过程，理解细胞如何组装成功能性胚胎，对于揭示发育障碍的起源具有基础性意义。
胚胎学研究长期以来高度依赖小鼠等模式生物，这些生物成本低廉且繁殖效率高。此类研究揭示了早期发育的基本原理。
为克服这些障碍，基于干细胞的胚胎模型应运而生。最初的尝试采用了来源于胚胎癌的拟胚体。
近年来，多能干细胞（PSC）响应机械化学线索而自组织的能力，使“类囊胚”——模拟囊胚发育关键特征的三维结构——得以构建。这些模型模拟了囊胚发育的诸多方面，并可在高通量条件下进行观察和操控，从而为谱系分离、细胞力学、着床以及表观遗传调控提供复杂的时空层面洞见。
在人类中，类囊胚已可由部分重编程的成纤维细胞生成。
尽管具有潜力，人类类囊胚研究仍受到伦理和法律限制。尽管国际干细胞研究学会（ISSCR）近期取消了限制胚胎研究的“一刀切”式“14天规则”。
非人灵长类（NHP）提供了一种有前景的替代方案。与人类模型相比，其伦理顾虑较少，样本可获得性更高，同时允许研究延伸至原肠胚形成及其后续阶段。
在300多种灵长类物种中，大猿（Great Apes，科
关于猩猩（
在此，我们报道了首次成功由北婆罗洲猩猩（
为模拟植入前发育，我们采用 AggreWell 平台，对依赖饲养层、无足迹的诱导多能干细胞（F
免疫染色证实了谱系分离，不同区域分别表达上胚层（EPI；OCT4、SOX2）、滋养外胚层（TE；GATA2、CDX2）以及原始内胚层/下胚层（PE/HYPO；SOX17、GATA4）标志物（图
为在单细胞分辨率下解析细胞身份，我们对210个猩猩类囊胚进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），获得了7,028个细胞的转录组。降维与聚类分析鉴定出7个转录上彼此不同的细胞群体（图
相关性分析表明，猩猩类囊胚与人类类囊胚及E6期人类囊胚的一致性更高（图。
值得注意的是，POU5F1 和 SOX2 在各簇中表现出异质性表达，这与它们在着床前发育过程中参与多种谱系的作用一致。
与单胚泡样体类似，双胚泡样体表现出类似人类囊胚的空间组织结构，包括位于外围的 GATA2+ 和 CDX2+ TE 样细胞、位于中央的 SOX2+ EPI 样细胞，以及 SOX17 PE/HYPO 样细胞和类囊胚腔结构（图。
为解析双胚泡样体内的谱系特化，我们对约 200 个聚集体进行了单细胞 RNA 测序，获得了超过 8,000 个单细胞转录组。降维与聚类分析揭示了九个在转录上彼此不同的细胞簇（图。
与红毛猩猩胚泡样体、人类胚泡样体和人类囊胚的比较分析
天然囊胚可提供多能性干细胞和滋养外胚层干细胞（TSCs）。为评估红毛猩猩胚泡样体是否具有可扩增的干细胞群体，我们铺板培养了双胚泡样体
在 TSC 支持条件下培养时，双胚泡样体
总体而言，这些结果证实红毛猩猩胚泡样体能够产生 ESCLC 和 TSCLCs，进一步验证了其质量。
在着床过程中，囊胚的滋养层细胞附着于子宫壁，黏附后，内细胞团形成前羊膜腔，随后启动原肠形成
在附着后第 5 天，部分 TE 样细胞显示出 HLA-G 类似物和 CGβ 的阳性染色，这些标志物与母胎耐受和妊娠早期维持相关（图。
本研究首次成功建立了无整合的红毛猩猩 iPSC，并进一步将其用于构建胚泡样体。红毛猩猩胚泡样体由具有谱系代表性的细胞群组成，其转录组特征类似于人类囊胚和人类胚泡样体，并捕捉到了围着床期发育的若干功能特征，其转录组特征类似于人类囊胚和人类胚泡样体。值得注意的是，与猕猴模型相比，红毛猩猩胚泡样体与人类囊胚表现出更高的转录相似性，凸显了其作为研究人类囊胚发育与着床的比较体系所具有的独特价值。
相关实验方案改编自开创性的人类胚泡样体研究
双胚泡样体方案显著优于单胚泡样体条件。有趣的是，F
尽管红毛猩猩胚泡样体、人类囊胚和人类胚泡样体之间的平均细胞数相当
胚泡样体模型的一个持续性局限在于谱系特化不完全。在不同物种中，胚泡样体常常缺乏明确的 PE/HYPO 区室
胚胎模型中的细胞类型注释在很大程度上受可用参考数据集的影响
囊胚样体来源细胞的功能评估不仅限于形态学比较。由红毛猩猩囊胚样体产生的 ESCLC 和 TSCLC 与来源于囊胚的 ESC 和 TSC 相对应。与在很大程度上不具备向 TE 分化能力的小鼠 PSC 不同，人类及其他类人猿的 PSC 具有这种能力。
进一步通过植入实验对其功能进行了验证。
该红毛猩猩囊胚样体模型弥合了人类与非灵长类系统之间的关键空白。它为研究早期胚胎发生提供了一个在伦理上可行且在科学上稳健的平台，而无需破坏胚胎。尽管当前的人类囊胚样体模型尚无法发育至早期阶段之后，但未来的进一步进展可能最终扩展其发育潜能，并引发伦理考量。在此背景下，类人猿囊胚样体构成了一种有价值的折中方案——既具有科学信息价值，又在伦理上可行。
囊胚样体系统——亦称为整合型干细胞胚胎模型、合成胚胎或类囊胚结构——为保护工作提供了独特机遇。对于极度濒危物种而言，由于天然胚胎稀缺或难以获得，囊胚样体可能为研究原本无法获取的发育阶段提供前所未有的窗口。
在此，我们建立了首批无整合的 iPSC 细胞系，来源于
因此，整合型干细胞胚胎模型可能拓展保护工具箱，使其超越人工授精、体外受精和体细胞核移植等技术；这些技术均受限于配子和胚胎的可获得性。因此，干细胞来源的囊胚样体可能提供一种可扩展的替代方案，尤其是在利用冷冻保存的体细胞生成时，能够从已死亡个体中恢复遗传多样性。
除其生成胚胎的潜力之外，囊胚样体还可用于系统探索种间相容性、滋养层生物学以及宿主—代孕体相互作用，而这些对于推进跨物种辅助生殖技术至关重要。结合生物样本库计划，基于 iPSC 的胚胎模型既可在当下保护受威胁分类群，也可为未来的生殖技术提供工具。
在生物多样性危机不断加速的背景下，基于干细胞的胚胎模型不应仅被视为发育生物学的实验平台，还应被视为保护工作的组成性工具。当与生殖技术和物种恢复策略相结合时，这些模型提供了一种面向未来的方法，并具有切实缓解生物多样性丧失的潜力。
本项目已获 Mandai Wildlife Group（MWG）研究委员会批准，项目编号为 MWG230104。本文稿准备过程中未对任何动物造成伤害。
分子与细胞生物学研究所——通过辅助生殖进行濒危物种保护（IMCB-ESCAR）实验室隶属于万态野生动物集团（Mandai Wildlife Group）。该集团是万态野生动物保留区（Mandai Wildlife Reserve）的管理机构，旗下包括新加坡动物园（Singapore Zoo）、夜间野生动物园（Night Safari）、河川生态园（River Wonders）、飞禽乐园（Bird Paradise）和亚洲雨林探险园（Rainforest Wild Asia）。
皮肤样本仅取自1只雌性北婆罗洲猩猩（
在尸检时，取动物耳部皮肤，用70%乙醇清洁并剃毛，随后对目标区域进行无菌外科准备。使用无菌手术刀片采集一块3 cm × 3 cm的全层皮肤样本。在无菌条件下，去除皮肤样本上残留的毛发、脂肪和表皮，并将样本切成更小的组织块。经PBS清洗后，将组织块置于含1× Antibiotic–Antimycotic（Gibco，15240062）的DMEM中，于室温孵育30 min。
再次用PBS清洗后，将组织块置于经0.1%明胶包被的无菌组织培养皿中，并在P0培养基中培养；P0培养基包含 Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）（Gibco，11966025）、20%胎牛血清（FBS）（Gibco，26140079）、1× Minimum Essential Medium（MEM）非必需氨基酸（NEAA）（Gibco，11140076）、1×青霉素–链霉素（Gibco，15140122）（相当于100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素），以及2 mM L-谷氨酰胺（Gibco，A2916801）。
所有细胞培养均在37°C、5% CO
细胞计数使用Countess™3自动细胞计数仪（Invitrogen，AMQAX2000）进行，并通过人工复核。将600,000个成纤维细胞分别用各2 µg质粒 pCXLE-OCT3/4-p53shRNA、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL 和 pCXWB-EBNA-1 进行转染（Addgene #27077、#27078、#27080 和 #37624，分别对应
将250,000个成纤维细胞接种于经0.1%明胶包被的3 cm培养皿中，并在FM培养基中培养。24 h后（第0天），使用CytoTune™-iPS 2.0试剂盒（Invitrogen，A16517）中的仙台病毒对成纤维细胞进行转导，该试剂盒含有人源表达盒
碱性磷酸酶染色使用Vector® Blue Substrate Kit（Alkaline Phosphatase）并按照制造商说明进行（Vector Laboratories，SK-5300）。
细胞以2.5 mg/ml 5-溴-2-脱氧尿苷和10 µg/ml秋水仙素处理过夜。随后用0.5%胰蛋白酶–EDTA消化10 min，使细胞解离，收集至离心管中，并用5 ml低渗溶液处理20 min，该溶液含75 mM KCl和0.8%柠檬酸钠。随后使用3:1甲醇与乙酸固定液进行多次固定。G显带和染色体分析按照标准程序进行：将细胞悬液滴加于洁净湿载玻片上并自然风干，随后置于90°C烘箱中，然后采用GTG显带技术染色；每个样本分析20个细胞，并完成5个完整核型分析。
参考核型图取自《哺乳动物染色体图谱》。
iPSCs经传代后，以1:3比例分种至超低吸附24孔板中。细胞在不含bFGF和hLIF的bFGF培养基中培养7天。形成的EB要么继续以悬浮状态维持培养7天后收集用于RNA提取，要么转移至包被0.1%明胶的培养板上继续培养7天后固定用于免疫染色。
囊胚样体的直径使用ImageJ（NIH，版本1.54f）进行测量。
为获得ESCLCs和TSCLCs，收集囊胚样体并接种于iMEF饲养层上，培养于补充10µM Y-27632的bFGF培养基中，或培养于滋养外胚层干细胞（TSC）培养基中，并每日更换新鲜培养基（不含Y-27632）。
TSC培养基包含DMEM/F12 GlutaMAX、0.2%表征型FBS（HyClone，SH30071.03）、0.3% BSA、0.1 mM β-巯基乙醇、0.5%青霉素-链霉素、1% ITS-X、0.5 mM VPA、50 ng/ml EGF、2 µM CHIR99021、1.5 µg/ml L-抗坏血酸、0.5 µM A83-01、1 µM SB431542、5 µM Y-27632。
ESCLCs和TSCLCs分别每4–6天使用ReLeSR™或TrypLE™进行传代，并以1:10–20比例分种至各自对应的培养基中，培养基每日或隔日更换。共建立了4–8条ESCLC和TSCLC细胞系。
为评估合体滋养层样细胞产生的绒毛膜促性腺激素（CG）的存在及浓度，收集IVC1和IVC2于
总RNA使用Monarch® Total RNA Miniprep Kit（New England BioLabs Inc.，T2010）提取，并采用iScript™ Reverse Transcription Supermix（Bio-Rad，1,708,840）逆转录为cDNA。qPCR采用KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix（2X）Universal（Kapa Biosystems，KK4618）进行，每个反应使用3.3 ng cDNA，引物终浓度为115 nM。
引物列于补充表1；其设计仅特异性识别预测的红毛猩猩序列。样本以重复孔或三重复进行检测，并且
贴壁细胞用PBS清洗，悬浮类器官用PBS中的0.04% BSA清洗。固定采用4% PFA处理10–12 min。封闭在室温下进行2 h；封闭液含有PBS中的2% BSA和0.3% Triton X-100。与一抗的孵育于4℃过夜进行，随后用洗涤缓冲液中的0.1% Tween-20清洗。与二抗和DAPI的孵育在室温避光条件下进行1 h。图像使用荧光显微镜（Nikon ECLIPSE Ts2，4X、10X、20X）或倒置共聚焦显微镜（ZEISS LSM 700，10X、20X）采集。
荧光显微图像或共聚焦显微图像分别使用ImageJ或ZEISS ZEN Microscopy Software（blue edition）（RRID:SCR_013672）进行图像叠加，并在必要时增强比例尺的可视化效果。抗体列于补充表2。对于囊胚样体，每种免疫染色条件至少在10个囊胚样体上进行。仅当所检测囊胚样体中有>50%显示出类似囊胚的胚胎系与胚外系谱的空间定位时，才展示相关图像。
对于单细胞RNA测序（scRNA-seq），210 F
获得10X Genomics数据后，采用Cell Ranger（RRID:SCR_017344）程序在默认参数下并基于ponAbe3基因组进行比对和UMI计数。Cellranger生成的feature-barcode计数矩阵用于在R中结合Seurat开展下游分析。在质量控制过程中，表达基因少于500个或线粒体基因含量超过10%的细胞被视为异常并予以剔除。表达于少于3个细胞中的基因被排除。采用主成分分析（PCA）进行降维后，使用20个维度进行统一流形近似与投影（UMAP）可视化。
使用FindAllMarkers函数鉴定每个簇或细胞类型中的差异表达基因（DEGs）。样本间的DEGs采用FindMarkers函数并结合Wilcoxon秩和检验进行鉴定，要求最小上调幅度为0.1 log-fold，校正后p值阈值为0.01。计算了每个样本中各细胞类型的平均表达值。这些步骤是在生物信息学专家协作下完成的。
对于公开可获得的人类囊胚数据集的整合
使用Monarch® Total RNA Miniprep Kit提取总RNA。
进行了质量控制，以确保总RNA样本满足以下标准：总量≥400 ng、体积≥20 µl、浓度≥20 ng/µl，RNA完整性数值（RNA Integrity Number, RIN）≥6.8（Agilent 2100™ Bioanalyzer），纯度（OD260/280和OD260/230）≥2.0（NanoDrop™ ND-1000 Spectrophotometer，Thermo Scientific，RRID:SCR_016517）。
对于bulk RNA-seq，每个样本由Novogene完成测序，测序深度为40M PE150 reads。使用STAR在默认参数下将reads比对至ponAbe3基因组。基因的GTF注释文件从UCSC genome browser下载。使用Cufflinks（v2.2.1）基于比对后的BAM文件和GTF注释文件进行基因组装与定量，生成每千碱基转录本每百万比对reads片段数（FPKM）表。使用Htseq（v.0.12.4）计算转录本计数。
对于具有重复的样本，采用DESeq2进行差异基因分析，p值截断为0.05，倍数变化截断为1.5。对于无重复的样本，采用EdgeR进行差异基因分析，p值截断为0.05。这些步骤是在生物信息学专家协作下完成的。
对在至少10%样本中具有至少5条比对reads的RNA-seq计数进行了主成分分析（PCA）。使用Bioconductor包sva（v.3.34.0）中的ComBat函数校正批次效应。PCA分析使用FactoMineR R包完成。在采用hclust函数进行层次聚类后，绘制了聚类树状图。
实验未进行随机化，在实验过程中及结果评估期间，研究人员未对分组分配实行盲法。除非另有说明，所呈现的数据和统计分析均使用 GraphPad Prism 进行绘图和分析。对于 qPCR，两个基因之间的相对标准化基因表达数据采用双样本 t 检验进行比较，使用双侧 p 值阈值 0.05，并采用 Levene 方差齐性检验，p 值阈值为 0.05；两个以上基因之间的相对标准化基因表达数据采用单因素方差分析，p 值阈值为 0.05，随后进行 Tukey 事后多重比较检验，p 值阈值为 0.05。
对于效率、形态学和 ELISA 数据，采用 Shapiro-Wilk 正态性检验，p 值阈值为 0.05；符合正态分布的数据采用单因素方差分析进行比较，p 值阈值为 0.05，随后进行 Tukey 事后多重比较检验，p 值阈值为 0.05；不符合正态分布的数据则采用 Mann-Whitney 检验或 Kruskal-Wallis 检验进行比较，p 值阈值为 0.05，随后进行 Dunn 事后多重比较检验，p 值阈值为 0.05；均值与参考均值之间的比较采用单样本双侧 t 检验，p 值阈值为 0.05。
作者声明不存在竞争性利益。
补充图 1、补充图 2、补充图 3、补充图 4、补充图 5、补充图 6、补充图 7、补充表
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© Research Square 2026 | ISSN 2693-5015（在线）
📄 原文链接：https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-8154543/v1
🏷️ 胚胎发生 类囊胚 多能干细胞 灵长类模型 人类发育模型