RBM47是小鼠胚胎干细胞分化的关键调控因子
Pavan Kumar Mysuru Shivalingappa、Divya Kumari Singh、Vaishali Sharma及另外3位作者
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https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1452998/v1
本作品采用CC BY 4.0许可协议授权
RNA结合蛋白（RBP）对于调控基因表达至关重要，因为它们参与RNA代谢的每一个步骤。多种RBP对哺乳动物的正常生长和发育是必需的。RNA结合基序47（RBM47）是一种含有RRM结构域的RBP，其在哺乳动物胚胎发育中的作用尚不清楚，但被认为是必需的，因为其在小鼠胚胎中的缺失会导致围生期致死。在本研究中，我们试图阐明RBM47在小鼠胚胎干细胞（mESC）命运决定中的重要性。下调
哺乳动物胚胎发生始于形成一个全能性的单细胞合子，随后进入一系列复杂事件，其中包括多种细胞类型的建立、细胞间相互作用，以及指导组织和器官模式形成以生成完整个体的机械和化学信号[
RNA结合基序47（RBM47）是一种新型的、脊椎动物中保守的RBP，含有三个RNA识别基序（RRM），在RNA编辑、早期胚胎发育和癌症中发挥多方面作用[
AB 2.2 mESC细胞系由英国Hinxton的Wellcome Sanger研究所惠赠。小鼠ESC在无饲养层条件下培养，使用0.2%明胶作为贴壁因子，培养于无血清ESC培养基中：knockout DMEM，补充15% KOSR、1×非必需氨基酸、1×GlutaMAX、0.1 mM
用于制备慢病毒的质粒如下：pLKO.1-TRC克隆载体由David Root提供（RRID:Addgene_10878）；psPAX2包装质粒和pMD2.G包膜编码质粒由Didier Trono提供（RRID: Addgene_12260和Addgene_12259，分别对应）。pLKO.1-TRC质粒经以下方式酶切
慢病毒在培养于补充10% FBS的DMEM/F12中的HEK 293T细胞中制备。这些细胞使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）进行逆向转染，导入慢病毒质粒。DNA混合液的制备方法为：将2.5 µg pLKO.1-shRNA质粒、2 µg psPAX2和1 µg pMD2.G加入Opti-MEM（Gibco）或任一无血清基础培养基中稀释至总体积243 µL，随后加入7 µL P3000试剂。
脂质混合液则在另一管中制备：将7 µL Lipofectamine 3000试剂加入243 µL Opti-MEM中稀释。通过将DNA混合液逐滴加入脂质混合液中获得DNA-脂质复合物。用移液器轻轻混匀后，在超净台内孵育10分钟。与此同时，HEK 293T细胞经胰蛋白酶消化、收集，并重悬于完全培养基中。将DNA-脂质复合物与5–6 × 10
小鼠ESC在铺板时于6孔板中进行转导，使用不同剂量的病毒浓缩液，悬浮于含有6 µg/mL polybrene的ESC培养基中，并孵育16–24 h。随后用新鲜培养基更换培养液，并继续培养1天。之后，使用含有1 µg/mL嘌呤霉素的培养基进行筛选，直至模拟转导细胞（无病毒）完全死亡。MOI按照先前所述方法，通过计数病毒转导细胞和对照细胞（无病毒/无嘌呤霉素）来确定[
按照生产商说明书，加入适量TRIzol Reagent（货号：15596-018；Ambion，Life Technologies）从所有细胞类型中分离总RNA。分离得到的总RNA使用DeNovix分光光度计进行定量。取总RNA（0.5–1.0 µg）使用Verso cDNA synthesis kit（Thermo Scientific）反转录为cDNA。
RT-qPCR按每个样本重复2次或3次进行，总反应体积为10 µL，其中包含2.5 µL按1:25稀释的cDNA模板、0.4 µM的正向和反向引物，以及PowerUp SYBR green master mix（Applied Biosystems，A25743），并在QuantStudio 6 Flex（Thermo Scientific）上运行。采用四阶段热循环程序（快速循环模式）。简言之，阶段I（保持）– 50℃ 2 min
小鼠ESC接种于包被0.2%明胶的96孔光学底板（Nunc 165305）中。弃去旧培养基后，用PBS清洗细胞。细胞在室温下用4%磷酸盐缓冲甲醛固定15分钟，并用PBS清洗3次。随后将细胞置于含5% BSA + 0.2% Triton-X的PBS中，进行30分钟的透化和封闭。细胞与用抗体稀释液（含1% BSA + 0.05% Triton-X的PBS）稀释的一抗（补充表3）在室温下孵育1小时。
用PBS清洗3次以去除多余抗体后，细胞与用抗体稀释液稀释的相应荧光团偶联二抗孵育，再用PBS清洗3次，并使用含有DAPI和抗淬灭剂DABCO（Sigma）的封片剂进行细胞核染色。样品在Thermo Scientific CellInsight CX7 LZR高内涵分析（HCA）平台上，采用宽场或共聚焦应用进行成像。图像随后使用ImageJ软件进一步处理。
稳定表达任一sh的小鼠ESC的体内分化潜能
定期监测小鼠畸胎瘤形成情况，并于4–5周时实施安乐死以收集畸胎瘤。使用游标卡尺记录畸胎瘤尺寸，椭球体体积按V = ½（长度×宽度
对于与细胞培养相关的实验，生物学重复表示在不同时间从不同培养皿/孔中收集的样本。采用 GraphPad Prism 8.2.1 (441) 进行作图和统计分析。两组之间差异的比较采用 Student’s t 检验，三组或三组以上的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并进行事后检验。关于所使用统计检验、重复次数及精确度测量的相关信息，均在各图例中注明。
统计学显著性定义如下：无显著性（ns）p > 0.05，* p
小鼠早期发育涉及在囊胚阶段三种谱系的确定。如图所示。
我们采用 RNAi 方法进行功能缺失研究，以探究……的重要性。
已有充分文献表明，在小鼠囊胚 E4.5 阶段，FGF4-ERK 信号通路是内细胞团（ICM）向 NANOG 阳性的上胚层（Epi）和 GATA6 阳性的原始内胚层（PrE）进行细胞命运决定的核心通路（图）。
RBM47 是一种在脊椎动物中保守的多功能 RNA 结合蛋白，已有研究提示其对发育、C 到 U 的 RNA 编辑以及肿瘤抑制至关重要[
本研究采用小鼠胚胎干细胞（ESC）及谱系特异性分化方法作为
我们的研究利用小鼠 ESC 有效重现了 RBM47 在早期哺乳动物发育中的重要性。我们证明了其在 ESC 向神经外胚层和内胚层谱系分化中的关键作用。此外，还需要开展体内研究，以全面理解由……所诱导的胎儿吸收和围产期致死的潜在异常机制。
概念构思：SAB、AS 和 PKMS；经费获取：AS；监督指导：SAB 和 AS；方法学：SAB、AS 和 PKMS；研究实施与正式分析：PKMS（ES 细胞培养与实验、RNA 分离、RT-qPCR、Western blot、免疫染色、分子克隆），DKS（RNA 分离、RT-qPCR、细胞周期与 Western blot），VS（RNA 分离与 RT-qPCR）以及 VA（RT-qPCR 与质粒筛选）；撰写—初稿准备：PKMS 和 SAB；撰写—审阅与编辑：SAB、PKMS。
所有作者均对论文的前期版本提出了意见，并阅读和批准了最终稿。
本研究得到印度政府生物技术部（BT/PR15178/MED/31/313/2015）以及国家细胞科学中心（NCCS）院内经费的资助。青年和高级研究奖学金资助情况如下：PKMS 由大学教育资助委员会资助；DKS 由生物技术部资助；VS 由印度医学研究理事会资助。VA 由项目资助 BT/PR 10708 支持。
论文及其补充信息文件包含了本研究期间产生的所有相关数据。
我们将本研究论文献给我们已故同事安贾利·希拉斯博士（Dr. Anjali Shiras），以纪念她不幸因 COVID-19 离世。我们衷心感谢艾伦·布拉德利教授（Prof. Alan Bradley）和 Wellcome Sanger Institute 提供 AB2.2 小鼠胚胎干细胞（ESCs）。我们感谢阿卡拉姆·巴加尔博士（Dr. Akaram Bagal）对畸胎瘤切片提出的意见。我们感谢 NCCS 的所有中心平台及其工作人员在研究过程中给予的支持。
作者在本文讨论的任何材料中均不具有经济利益或专有权益。
关于多能干细胞（ESCs/iPSCs）的实验符合《国家干细胞研究指南》（2013 年和 2017 年），并已获得 NCCS 干细胞研究机构委员会的伦理批准（编号：NCCS/IC-SCR/2016-I/3）。动物实验按照 CPCSEA 指南开展，并已获得研究所动物伦理委员会的伦理批准（编号：EAF/2015/B-253 和 EAF/2019/B-351）。本研究中使用的重组 DNA 技术符合生物技术部的生物安全指南，并已获得机构生物安全委员会的伦理批准（编号：2015033 和 2018111）。
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© Research Square 2026 | ISSN 2693-5015（网络版）
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🏷️ RBM47 胚胎干细胞 细胞分化 RNA结合蛋白 胚胎发育