人类胚胎形态塑造始于致密化，在此过程中，细胞彼此紧密接触并形成更为致密的结构
包括哺乳动物在内的模式生物的力学表征，极大地推动了我们对动物形态发生的理解
人类形态发生始于第4天的致密化
在致密化过程中，细胞最大化其细胞—细胞接触面积，并最小化其暴露于外部培养介质的表面积
(a) 张力测绘方法示意图。使用半径为
由于单个胚胎内卵裂球的卵裂分裂可能彼此相差数小时发生，致密化发生时相邻细胞可处于不同的卵裂阶段（
在小鼠胚胎中，张力的增加
(a) 人类胚胎致密化前（上）和致密化后（下）的免疫染色代表性图像，其中MYH10为绿色，F-肌动蛋白为红色，CDH1为蓝色。比例尺，20
为检验收缩性是否负责产生驱动人类胚胎致密化的张力，我们对已致密化胚胎使用了肌球蛋白轻链激酶抑制剂ML7。ML7使胚胎发生去致密化，接触角在数分钟内下降了27 ± 2°（来自6个胚胎的平均值 ± SEM，配对Student’s t检验，p < 10
尽管在致密化过程中缺乏明显的分子重组（
综上，我们发现，尽管细胞收缩性和细胞—细胞黏附二者对于人类胚胎的致密化都是必需的（
有趣的是，收缩性和黏附的丧失会导致不同的力学特征（
为确定致密化缺陷的力学起源，我们测量了自发性致密化失败胚胎的张力。我们将当没有任何接触角增大到131°以上时判定为致密化失败，该阈值是基于7个正在致密化和7个未致密化胚胎的统计结果确定的
(a) 致密化失败胚胎的代表性图像，其中在第3
后超过30小时内，没有任何细胞接触达到131°
另一种常见的致密化缺陷是部分致密化，即部分卵裂球未参与致密化细胞团块的形成
为研究这一机制，我们测量了表现出部分致密化的胚胎的张力（
综上，利用人类着床前胚胎的力学特征
J.F.、H.T.、C.P.和J.-L.M.提出项目构想并获得经费资助。J.F.和J.-L.M.设计实验。J.F.实施实验。J.F.和J.-L.M.分析数据。J.F.、D.N.D.、V.B.L和C.P.组织胚胎采集。N.E.和H.T.撰写理论部分并进行数值模拟。J.-L.M.在J.F.、N.E.、H.T.和C.P.的意见基础上撰写论文。
本项目所使用的人类捐赠胚胎经法国生物医学署（Agence de la Biomédecine，ABM，批准编号RE 17-011R）批准，且符合国际干细胞研究学会指南。
捐赠胚胎在Fertilité Paris Centre ART Center（Biologie de la reproduction-CECOS, Cochin, APHP.Centre-Université de Paris）、Clinique La Muette（法国巴黎）或Clinique Pierre Chérest（法国Neuilly sur Seine）进行冷冻保存和储存。随后，胚胎被转运至Institut Curie，并立即复苏用于本研究项目。
本研究共使用了由33对患者夫妇提供的43枚胚胎。胚胎于第2天（n = 24）或第3天（n = 19）采用慢速冷冻程序（n = 30）或玻璃化冷冻（n = 13）进行冷冻。在冷冻时，第2天和第3天胚胎的平均细胞数分别为4 ± 1个细胞（平均值 ± 标准差，最少2个，最多8个）和8 ± 1个细胞（平均值 ± 标准差，最少6个，最多10个）。对于压实全过程中的测量（
胚胎的冷冻保存时间为11.2 ± 4.9年（平均值 ± 标准差；慢速冷冻和玻璃化冷冻胚胎分别为13.6 ± 4.0年和5.7 ± 1.1年）。
供体的平均年龄分别为女性34.1 ± 3.5岁、男性36.3 ± 6.3岁（平均值 ± 标准差；33对夫妇中有30对提供了相关数据，另有3对数据目前缺失）。31/41枚胚胎由卵胞浆内单精子注射（ICSI）产生，10/41枚胚胎通过常规体外受精（IVF）获得。所有精子均为新鲜精子。
胚胎在配备加热板（Leica MATS-Type TL base，必要时设定为37°C）的体视显微镜（Leica M80）下，使用Stripper微量移液管（Origio）进行操作。
冷冻保存的胚胎按照生产商说明进行复苏。慢速冷冻胚胎使用Embryo thawing packs（Origio）进行复苏，玻璃化冷冻胚胎使用Vit Kit（Irvine Scientific）进行复苏。完整存活率定义为复苏后立即观察到无任何细胞裂解的胚胎百分比；在随后纳入实验分析的胚胎中，该比例为88.6%（39/43）。所有胚胎在复温过程中均存活，且至少有50%的细胞保持完整。
胚胎在配备加热板（Leica MATS-Type TL base，设定为37°C）的体视显微镜（Leica M80）下，使用Stripper微量移液管（Origio）进行操作。胚胎被置于预平衡的培养条件中（至少在37°C、5% O
在表面张力测量之前，胚胎从其
ML7（Sigma-Aldrich, I2764）以50% EtOH稀释至10 mM。第4天压实胚胎首先置于含1:2000 EtOH的培养基中15 min，随后进行额外30 min的表面张力测量。之后将胚胎转移至含10 μM ML7的培养基中15 min，再进行30 min的表面张力测量。随后将胚胎重新置回常规培养基CSCM-C中恢复培养。6/6枚胚胎均重新压实，且5/6枚胚胎形成了囊胚。
同样地，第4天压实胚胎被置于Embryo Biopsie Medium（Irvine Scientific）中，这是一种不含Ca的商业培养基
胚胎在37°C下用2% PFA（Euromedex，2000-C）固定10 min，随后在PBS中清洗，并在室温下于PBS中的0.01% Triton X-100（Euromedex，T8787）（PBT）中进行透化处理，之后置于封闭液（含3% BSA的PBT）中，于4°C封闭至少4 h。一级抗体于4°C下在封闭液中孵育过夜。经室温PBT清洗后，胚胎于室温下与二级抗体、DAPI和鬼笔环肽共同孵育1 h。随后将胚胎在PBT中清洗，并立即在矿物油覆盖下置于含BSA的PBS中进行成像。
为制备微吸管，采用P-97 Flaming Brown拉针仪（Sutter Instrument）对玻璃毛细管（World Precision Instruments，TW100-3）进行拉制，参数设置如下：Ramp +3–5，Pull 55，Velocity 50，Time 50，Pressure 500。
使用微锻针仪（Narishige，MF-900）将针切割形成半径为12–22 μm的钝性开口，并在距针尖80–100 μm处以20°角进行弯折。
微吸管通过夹持头和毛细管固定器（Eppendorf，920007392和9200077414）安装于微操纵器（Leica AM6000）上。微吸管连接至一个充满PBS的中间储液槽，通过50 mm微尺度平移台（Newport）控制其高度，以产生正压和负压。
为测量细胞表面张力，在较低吸持压力（20–30 Pa）下，使微吸管与胚胎中一个卵裂球的自由表面接触。
在测量胚胎中两个相邻细胞的表面张力后，我们假定在测量时间尺度上系统处于稳态，并根据细胞-细胞接触处的力平衡方程计算界面张力。
表面张力测量在Leica DMI6000 B倒置显微镜上进行，配备40x/0.8 DRY HC PL APO Ph2（11506383）物镜。Retina R3相机前安装有一枚0.7x镜头。显微镜配有定制孵育腔（EMBLEM），用于将样品保持在37°C并维持5% CO₂气氛。
对于延时成像，胚胎在复苏后置于CellDiscoverer 7（Zeiss）的腔室内，在37°C、5% O₂加湿条件下进行培养和成像。
免疫染色样品使用配备CSU-X1转盘共聚焦单元（Yokogawa）的Zeiss Observer Z1显微镜进行成像，采用405、488、561和642 nm激光线，通过63x/1.2 C Apo Korr水浸物镜；发射信号经450/50 nm、525/50 nm、595/50带通或610 nm低通滤光片收集，并由ORCA-Flash 4.0相机（C11440，Hamamatsu）记录。
移液管尺寸、细胞曲率半径和接触角分别使用Fiji中的直线、圆和角度工具进行测量。
为测量皮质荧光强度，采用先前所述的方法。
均值、标准差、SEM和Pearson相关系数使用Excel（Microsoft）计算。统计学检验使用免费在线工具BiostaTGV进行。
接触角阈值使用Cutoff Finder确定。
非紧实化胚胎和完全紧实化胚胎根据 ESHRE 指南进行了定性评估。
样本量并非预先确定，而只是实验重复的结果。没有排除任何样本。未使用随机化方法。研究人员在实验过程中未实行盲法。
用于分析的图像和数据将上传至公共数据库。
完全紧实化、非紧实化和部分紧实化胚胎的卵裂球阶段通过追踪连续细胞分裂直至最后一次张力测量来确定（分别为 7、6 和 6 个胚胎，以及 40、32 和 33 个卵裂球）。对于部分紧实化胚胎，紧实化卵裂球、与被排除细胞相邻的紧实化卵裂球以及被排除细胞的阶段分别单独标示（分别为 13、10 和 10 个）。
最后一次观察到的 3 之后时间的均值、均值标准误（SEM）以及细胞和胚胎数量
外部接触角 θ 的均值、均值标准误（SEM）以及细胞和胚胎数量
最后一次观察到的 3 之后时间的均值、均值标准误（SEM）以及细胞和胚胎数量
最后一次观察到的 3 之后时间的均值、均值标准误（SEM）以及细胞和胚胎数量
在我们的研究中，我们假设着床前人类胚胎中卵裂球的形状主要受皮质张力控制，这与其他早期胚胎中的情况类似（
对于一个细胞双联体，我们在下文回顾（中提出的一些结果
细胞—细胞连接处的 Young-Dupré 定律：
其与体积约束共同决定双联体的几何形状
（左）细胞双联体的示意图，显示细胞—培养基界面和接触界面的表面张力
Young-Dupré 定律可重写为内外接触角的函数
需要注意的是，上述力平衡方程并不限于细胞双联体，而是适用于细胞之间任何接触和连接处。因此，下文我们将其直接应用于人类胚胎。
在对称双联体或对称细胞—细胞接触的情况下，即当
该问题可重新表述为一个几何问题，其中我们寻求点之间的最小距离
在人类胚胎中，紧实化参数
相比之下，在小鼠中，通过增加时，紧实化参数 α 从 0.72 降至 0.28
从图形上看，这些最短路径可以绘制在双对数坐标的相图上。为了便于比较小鼠和人类情况，我们在下图中将所有张力都按其初始值进行了归一化
归一化张力相图（双对数坐标），比较了人类和小鼠胚胎紧实化过程的实验演化（分别以黑色和白色实线表示）与使张力变化最小的对应演化路径（虚线）。紧实化状态
该图表明，在这样的相图中，小鼠和人类胚胎都远离最小压实路径，但小鼠胚胎在最小化其张力变化以达到最终压实状态方面表现更优。
通过令拉格朗日函数关于双细胞体形状几何和拉格朗日乘子的导数为零，可得到最优性条件（
将上述细胞双体的方法加以推广，我们的数值模拟包括对定义在初始非流形三角网格上的表面能进行约束优化。对于一组的表面能和拉格朗日函数
由拉格朗日函数可以计算出力
界面面积和细胞体积可以很容易地表示为三角形上的求和
它们关于顶点位置的导数
在机械平衡时，所有界面都遵循拉普拉斯定律，并且每个连接处都满足杨-迪普雷方程。这些方程也可以等价地表示为表面能的约束优化
这导出了一个关于的线性方程组
为了找到机械平衡，需要求解方程
在每次迭代中，按照上述投影方法重新计算细胞压力。
约束优化方法被应用于非流形多材料网格，遵循（
对于压实，相关对照实验已在（
一种情况是胚胎完全压实，其细胞-培养基表面张力的初始值和最终值为
另一种情况是该胚胎中的一个细胞具有其细胞-培养基张力
排除细胞与压实细胞之间接触角随接触张力数值变化的图
为了获得细胞形状的平滑演化，张力值在总计15个点上从初始值到最终值进行线性插值。模拟中使用的初始和最终张力值相较于实验值缩小了1000倍，并在图中以向右箭头分隔
模拟中使用的张力值。单位对应于1000 pN/
我们感谢居里研究所遗传学与发育生物学单元的成像平台（PICT-IBiSA@BDD），该平台是法国国家研究基础设施 France-BioImaging（ANR-10-INBS-04）的成员，感谢其提供的卓越支持。我们感谢 Nadia Kazdar、Lucie Delaroche、Anne Le Dû，以及来自 La Muette 诊所（法国巴黎）、Pierre Chérest 诊所（法国纳伊-叙尔-塞纳）和 Cochin 医院（法国巴黎）的 ART 团队全体成员对人类胚胎实验的支持。
我们感谢 Maître 实验室全体成员、Y. Bellaïche 和 M.-H. Verlhac 的讨论与意见。我们感谢 M.-H. Verlhac 在整个项目期间对行政事务的支持。我们由衷感谢将其剩余胚胎捐赠用于科研的患者。
本项目由巴黎文理研究大学（Paris Sciences et Lettres, PSL）QLife（ANR-17-CONV-0005）资助，受资助者为 J.-L.M.、C.P. 和 H.T.；同时还获得法国国家健康与医学研究院（INSERM）横向项目“人类发育细胞图谱”（Human Development Cell Atlas, HuDeCA）对 J.-L.M. 和 C.P. 的资助。
J.-L.M. 实验室的研究得到居里研究所（Institut Curie）、法国国家科学研究中心（Centre National de la Recherche Scientifique, CNRS）和法国国家健康与医学研究院（Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, INSERM）的支持，并获得以下项目资助：Schlumberger 教育与研究基金会（Fondation Schlumberger pour l’Éducation et la Recherche）经由法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale）提供的资助、欧洲分子生物学组织青年研究员计划（European Molecular Biology Organization Young Investigator Program, EMBO YIP），以及 Labex DEEP（ANR-11-LABX-0044，属 IDEX PSL ANR-10-IDEX-0001–02 的一部分）。
J.F. 获得法国医学研究基金会奖学金资助（FDM202006011290）。H.T. 和 N.E. 开展的工作得到法国国家科学研究中心（CNRS）和法兰西公学院（Collège de France）的支持。本项目未使用欧洲研究委员会的任何资助经费。
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📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.01.09.475429
🏷️ 人类胚胎 致密化 形态发生 细胞力学 细胞黏附 肌球蛋白收缩性