尽管在模式系统中已被广泛研究，人类原肠胚形成过程仍然不甚清楚。该过程始于囊胚植入子宫壁，这通常被认为发生在受精后14天之后。胎儿生物材料的稀缺与获取受限，以及伦理方面的考量，限制了我们对人类原肠胚形成细胞与分子图谱的理解。
培养体系的建立使得
近期研究表明，初始态人胚胎干细胞（naïve hESCs）能够自组织形成三维囊胚模型（
RUES2（NIHhESC-09-0013）细胞通过化学重置（chemical resetting）由植入后“预备态”（primed）重新编程为植入前“初始态”（naïve）（
经化学重编程的初始态RUES2 hESCs表现出植入前标志基因，并能够产生
A）对预备态（CM+FGF2）和初始态（N2B27+PXGL）RUES2 hESCs进行免疫染色显示，在两种条件下均表达核心多能性基因OCT4、SOX2和NANOG。免疫染色伪彩：OCT4（绿色）、SOX2（蓝色）、NANOG（洋红色）以及DAPI（灰色）。比例尺：50 μm。
B）通过免疫染色分析转录因子KLF17和表面标志物SUSD2的表达，可区分初始态与预备态多能干细胞。免疫染色伪彩：KLF17（红色）、OCT4（绿色）、SUDS2（黄色）以及DAPI（灰色）。比例尺：50 μm。
原条和中胚层诱导过程中
A）PALLY-LY分化的明场图像
D）10 dpa时的免疫染色显示OCT4
G）面积定量结果以散点图显示。x轴表示标准化后的OCT4，y轴表示BRA标准化面积。每个点代表一个单独附着的
采用两个不同时间点（7和10 dpa）进行scRNA-seq分析。共鉴定出16个不同的细胞簇，包括三胚层衍生细胞和胚外细胞（
A）UMAP图显示了四种主要细胞身份及其特异性标志基因：上胚层/外胚层（POU5F1/OCT4）、中胚层（VIM）、内胚层（FOXA2）和胚外外胚层（GATA3）。
B）UMAP图展示了7–10 dpa scRNA-seq数据集中鉴定出的细胞群体，并根据分析时间和细胞注释进行着色。热图显示了7和10 dpa时区分各个细胞群体的标志基因标准化计数。
C）UMAP图显示了胚外亚谱系（羊膜、细胞滋养层和合体滋养层）。z-score热图展示了区分羊膜（ISL1、VTCN1、GABRP）、细胞滋养层（MKI67、VGLL1、ITGA6）和合体滋养层（SDC1、ERVV-1、PSGC3）的标志基因。上胚层/外胚层亚谱系（外胚层、上胚层、PGC和早期原始条）。
z-score热图展示了区分外胚层（SOX2、OTX2、CRABP1）、上胚层（KLF17、DPPA5、UPP1）、早期原始条（TBXT、MIXL1、TBXT）和PGC（SOX17、TFAP2C、NANOS3）的标志基因。中胚层亚谱系（心脏中胚层、中胚层1-2-3、原始条2和内皮）。
z-score热图展示了区分原始条2（TDGF1、MESP1、WNT3）、心脏中胚层（TNNT2、TNN1、HAND2）、内皮（PECAM1、KDR、MEF2C）和中胚层3（MASP1、CD33、SLC4A8）的标志基因。内胚层亚谱系（确定性内胚层、下胚层和卵黄囊内胚层）。z-score热图展示了区分确定性内胚层（OTX2、SHISA2）、下胚层（VEPH1、RSPO3）和卵黄囊内胚层（AFP、APOB）的标志基因。
10 dpa时滋养外胚层和羊膜的胚外细胞。
对原始条细胞群的单细胞表征
A）原始条簇的UMAP图显示了前部（OTX2、LHX1、HHEX）和后部（EVX1、CDX2、NKX1-2）标志基因的表达。
B）UMAP图显示了Spemann组织者标志基因（GSC、CER1、FST、NOG）的表达。
A）热图显示了7和10 dpa时区分胚外（GATA3、GATA2、HSD3B1、KRT7）、上胚层/外胚层（POU5F1、NANOG、DPP5、UTF1）、中胚层（ZEB2、VIM、HAND1、CDH11）和内胚层（FOXA2、SOX17、HNF1B、HNF4A）细胞群的标志基因的z-score标准化表达值（7 dpa：7354个细胞；10 dpa：5489个细胞）。
B）UMAP图显示了鉴定出的细胞群：细胞滋养层、合体滋养层、羊膜、上胚层、外胚层、始原生殖细胞、原始条1-2、中胚层1-2-3、心脏中胚层、内皮、确定性内胚层、下胚层和卵黄囊内胚层。
C）平均标准化表达热图显示了区分各个细胞群的标志基因。
随后，我们将我们的数据集与近期发表的scRNA-seq转录组图谱进行了比较，该图谱为
A）使用Zhao等，2021年提出的Embryogenesis Prediction工具预测的细胞类型以UMAP空间中的不同颜色显示（颜色编码：上胚层、原始条、中胚层、内胚层、滋养外胚层和羊膜细胞群）。
D）体外贴壁培养的人类类囊胚（7和10 dpa）的scRNA-seq与小鼠原肠胚形成数据集进行了整合（
E）体外贴壁培养的人类类囊胚（7和10 dpa）的scRNA-seq与猴早期器官发生数据集进行了整合（
A）将体外附着的人类类囊胚（7和10 dpa）的 scRNA-seq 数据与人类三维培养胚胎（Xiang 等，2019）数据，使用 scanorma 及共同检测到的高变基因进行整合。UMAP 展示了各个单独的细胞群。来自该数据集的细胞群另标注为“hE_3D”。相关性分析以 z-score 热图显示。层次聚类以树状图形式展示于……之间。
B）将体外附着的人类类囊胚（7和10 dpa）的 scRNA-seq 数据与体外附着的猴胚胎数据集进行整合（
A）UMAP 显示了 7–10 dpa 的整合结果
B）利用人类原肠胚数据集之间共同检测到的高变基因进行相关性分析（
C）层次聚类以树状图形式展示。人类原肠胚（
原肠形成的起始受一条以 BMP4 开始的信号级联调控，随后其诱导 WNT，而 WNT 与 NODAL 协同控制中胚层和内胚层分化（
A）scRNA-seq 分析以热图形式展示了……各个单独细胞群中 BMP4、WNT3 和 NODAL 配体的平均标准化表达量
B）scRNA-seq 分析以小提琴图形式展示了 ID2 和 LEF1 的表达水平，它们分别是 BMP 和 WNT 信号通路的即刻早期靶基因。
H）免疫染色定量分析 BRA 所占据的面积
阐明人类原肠形成的细胞与分子逻辑，对于理解身体轴形成的基本原理以及与胚胎发育失败相关的早期流产的潜在原因，具有重大意义。据估计，多达 30% 的全部流产发生于妊娠第二周之后（
RDS 构思了该项目，完成了人类胚胎和
A.H.B. 是 RUMI Scientific 和 OvaNova 的联合创始人。A.H.B. 和 E.A.R.O. 是 RUMI Scientific 的股东。R.D.S.、E.R.、G.C. 和 M.Y. 声明不存在需披露的利益冲突。
本手稿所述研究已根据大学关于涉及人胚胎干细胞和人类胚胎研究的政策，经洛克菲勒大学机构审查委员会批准，并由三校干细胞倡议胚胎干细胞监督（Tri-SCI ESCRO）委员会监管。该委员会负责监督人类胚胎研究监督（EMRO），并服务于洛克菲勒大学、纪念斯隆凯特琳癌症中心和威尔康奈尔医学院。ESCRO委员会是一个独立机构，负责监督涉及人多能干细胞和胚胎的研究，以确保其符合大学政策。Tri-SCI ESCRO委员会由具备科学和生物伦理学专长的成员组成。
既定ESCRO方案每年接受审查，并遵循ISSCR 2021指南。用于研究的多余IVF来源人类胚胎由人类生殖中心和耶鲁生育中心提供捐赠。胚胎捐赠通过知情同意程序完成，符合美国国家科学院（NAS）《人胚胎干细胞研究指南》和经ESCRO审查研究的三校干细胞研究操作程序。
人多能干细胞培养与化学重编程 RUES2人胚胎干细胞（hESCs，NIHhESC-09-0013）在铺有Geltrex涂层的培养皿（ThermoFisher Scientific）上，使用添加FGF2（20 ng/mL）的MEF条件培养基（CM）维持于始发态。CM-FGF2培养基每日更换，细胞每3–5天使用Accutase或ReleSR（ThermoFisher Scientific）传代一次。
向naïve状态的重编程按照以下方法进行
人naïve多能干细胞在PXGL培养基中可维持培养至25代。naïve细胞经Accutase单细胞消化后，每3–5天在MEF饲养层平板上进行传代，所用PXGL培养基中补充ROCK抑制剂（10 μM）和Geltrex（1%）。
naïve人多能干细胞经分化形成
冷冻保存的IVF来源人类胚胎（受精后第5–6天，5–6 dpf）按照制造商说明，使用Kitazato试剂盒（VT602US，Kitazato USA）进行复苏。简言之，装有单个胚胎的细管先置于TS1溶液中1分钟，随后在DS2溶液中处理两次，每次2分钟，再在WS3溶液中处理两次，每次3分钟。胚胎随后置于矿物油（FUJIFILM）覆盖下的GLHP培养基滴（GlobalHP）中培养过夜。次日，将孵出的囊胚转移至铺有Laminin-521涂层的IBIDI 8孔板中，并使用IVC1培养基培养。
48小时后，将50%的培养基更换为IVC2培养基。此后每日更新50%的IVC2培养基，直至实验结束。
第7天和第10天的样本经酶消化获得单细胞（Geltrex 5%）
10X Genomics文库使用NovaSeq 6000（Illumina）进行测序，FASTQ文件采用Cell Ranger（7.0.0）比对至hg38参考基因组。Cell Ranger生成的计数矩阵在Python中使用Scanpy进行处理（
原始计数矩阵和细胞注释可在 GEO 数据库中获取，登录号为 GSE225893。
OCT4，Santa Cruz Biotechnology（sc-5279），1:200
GATA3，Thermo Fisher Scientific（14-9966-82），1:100
MIXL1，Sigma Prestige 抗体（HPA005662），1:200
SUSD2，Miltenyi Biotec（130-106-401），1:100
SSEA4，Miltenyi Biotec（130-122-958），1:100
GATA4，Thermo Fisher Scientific（14-9980-82），1:100
图像采用激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss Inverted LSM 780 或 Zeiss Inverted LSM 940）获取，使用 ×10、×20 干式物镜和 ×63 油镜物镜。
图像使用 ZEN black 软件或 Fiji_V2（Version 2.1.0/1.53c）沿 z 轴对 z-stack 进行最大强度投影（MIP）显示。Fiji 软件用于图像处理、对比度调整和导出。各个通道阳性信号的面积是在经过 Ilastick 像素分类后的 MIP 图像上计算的（
我们感谢 Brivanlou 实验室成员提出的意见和批评。我们感谢 Rockefeller Bio-Imaging Resource Center 提供成像技术支持，并感谢 NYU Genomic Core Facility 提供测序技术支持。
我们还要感谢 Center for Human Reproduction 的 Dr. Norbert Gleicher 和 Yale Fertility Center 的 Dr. Pasquale Patrizio 为本研究提供患者捐赠的人类胚胎，并感谢 Dr. Emanuela Molinari 在胚胎处理方面提供帮助。R.D.S. 获得了 EMBO-LTF-254-201 的资助。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.05.16.541017
🏷️ 人胚胎干细胞 原肠胚形成 初始态多能性 体外培养 化学重编程