能够高效生成滋养层和上胚层两种谱系的干细胞的缺乏，阻碍了对胚胎发育过程的精准重现。通过高内涵化学筛选，我们建立了一种AL培养基，用于生成小鼠和人双向多能干细胞（bidirectional pluripotent stem cells, BPSCs），其特征为同时表达OCT4/CDX2。小鼠BPSCs在体外48小时内无需外源诱导因子即可高可塑性地分化为滋养层、上胚层和原始内胚层谱系，并且在体内能够高效贡献于胚胎及胚外组织。
从机制上看，Wnt信号通路的高激活通过启动一种依赖Lef1的旁路，打破了早期谱系分化屏障。值得注意的是，BPSCs能够高效生成E8.5类胚体，完成原肠胚形成，并表现出脑发育、封闭的神经管、搏动的心脏、体节形成以及原始生殖细胞等高级特征。这些发现凸显了BPSCs作为研究早期谱系决定和原肠胚形成后胚胎发育的有力工具的价值，并在多物种中的应用具有潜力。
哺乳动物胚胎经历两次关键的细胞命运决定，从而形成着床前的三种谱系：滋养外胚层（TE）、上胚层（Epi）和原始内胚层（PrE）。
由于谱系屏障的建立，ESC向TSC的转化通常需要强制表达外源转录因子（CDX2）。
构建类胚胎结构是一种通过多种细胞系的三维共培养来重现胚胎发育过程的方法。目前，通过多种细胞的共培养，已经可以获得胚泡样体（blastoids，囊胚样结构）、原肠胚形成类胚胎结构（胚胎第6.5天样结构，E6.5-like structure）以及原肠胚形成后的合成胚胎（E8.5-like structure）。
在本研究中，通过高内涵筛选，我们鉴定出一种细胞培养条件，能够便捷且无损地使小鼠和人多能干细胞同时表达两者。
为了筛选促进多能干细胞向滋养层谱系细胞分化的培养条件，我们首先建立了扩展多能干细胞（EPSC）系，其具有
（A）LY处理细胞的浓度测试。代表性形态学图像和
（B）AS处理细胞的浓度测试。代表性形态学图像和
（C）小提琴图显示代表性基因表达（
（D）桑椹胚（16细胞期，上）、E3.5囊胚（中）和E4.5囊胚（下）的免疫荧光染色。CDX2和OCT4染色。比例尺，20 μm。
（E）EBPSC（于AL培养基中由桑椹胚衍生）的核型分析。
（F）E12.5日四倍体补偿胚胎及生殖嵴的明场图像。△PE-
（A）用于……的化学文库筛选示意图
(B) 维恩图显示，与阴性对照相比，261种小分子可显著提高GFP表达，10种可显著提高mCherry表达。两组共同的小分子为LY2090314和AS1842856。
(C) 代表性FACS分析，显示……的百分比
(D) 代表性形态学图像及
(E) EPSC和EPSC-AL-D3的免疫荧光染色。检测CDX2和OCT4。比例尺，20 μm。
(F) EPSC、TSC和EPSC-AL-D2中核蛋白OCT4和CDX2的代表性FACS分析。
(G) 代表性形态学图像及
(H) 代表性FACS分析，显示……的百分比
(I) E18.5天四倍体补偿胚胎及成年小鼠的明场图像。
(J) 示意图（左图）显示BPSC流式分选及传代培养两个代次。代表性FACS分析显示Oct4-GFP阳性和CDX2-mCherry阳性细胞的百分比（右图）。
在首次细胞命运决定之前，小鼠胚胎也表现出关键转录因子的共表达
接下来，我们考察了BPSC是否能够在体外长期维持。培养和荧光激活细胞分选（FACS）分析显示，BPSC在超过10代传代过程中仍可保留高达41.58%的CDX2和OCT4双阳性细胞，并维持圆顶状克隆形态（
为了探究CDX2和OCT4双阳性细胞组成比例的稳定性，我们从BPSC中流式分选出单阳性（Oct4+/Cdx2-）和双阳性（Oct4+/Cdx2+）细胞亚群，并分别在AL培养基中维持培养（P0）。值得注意的是，到第1代（P1）时，这两个亚群均重新建立了双阳性细胞的原始平衡（
先前研究表明，小鼠多能干细胞或类全能干细胞若无滋养外胚层（TE）核心转录因子CDX2的外源表达，无法快速转化为TSC
(A) BPSC（来源于EPSC）、ESC和EPSC在无诱导因子条件下自发分化2天的示意图。
(B) BPSC（来源于EPSC）、ESC和EPSC在无诱导因子条件下自发分化两天后的典型明场图像。
(C) BPSC（来源于EPSC）、ESC和EPSC自发分化2天后的免疫荧光染色。检测OCT4、CDX2和GATA6。比例尺，50 μm。
(D) BPSC（来源于EPSC）、ESC和EPSC自发分化2天后的代表性FACS分析。
(E) 来自E4.5胚胎细胞、BPSC（来源于EPSC）自发分化1天或2天后，以及EPSC自发分化2天后的scRNA-seq数据的UMAP图。细胞根据其细胞类型着色，并按其来源分组显示。
(F) 采用TSM诱导BPSC分化2–3天的示意图。诱导3天后，通过FACS分选收集CDX2-mCherry阳性或CDCP1阳性细胞，并继续使用TSM进行培养。诱导2天后，将细胞注射到8细胞期胚胎中进行嵌合实验。
(G) 对BPSC-TSC（来源于EPSC）、BPSC-TSC（来源于ESC）以及TSC（来源于胚胎）进行免疫荧光染色。检测SOX2和TFAP2C。比例尺，20 μm。
(H) 采用上述方法制备的E6.5嵌合胚胎的免疫荧光染色（
(I) E12.5时期嵌合胎盘的免疫荧光染色。检测TPBPA和GFP。比例尺，500 μm。
为探究其发育状态，我们对BPSC和EPSC自主分化细胞的scRNA-seq数据进行了UMAP分析（
(A) E4.5胚胎细胞、BPSC（来源于EPSC）自发分化1天或2天后，以及EPSC自发分化2天后的上胚层（Epi）谱系、滋养外胚层（TE）谱系和原始内胚层（PrE）谱系代表性基因表达。
(B) 采用流式细胞术分选单阳性和双阳性细胞，并排除PDFFRA阳性细胞。
(C) 自发分化2天后Oct4+/Cdx2+和Oct4+/Cdx2−细胞的免疫荧光染色。检测OCT4、CDX2和GATA6。比例尺，20 μm。
(D) 在有或无FGF4和肝素条件下分化细胞的免疫荧光染色。检测OCT4、CDX2和GATA6。比例尺，20 μm。
(E) 堆叠柱状图显示在有或无FGF4和肝素条件下Oct4+/Cdx2+和Oct4+/Cdx2−细胞分化的百分比。
由于BPSC由单阳性（
为确定是否能够建立TSC细胞系，采用定向诱导培养基（含Fgf4和肝素的TSM）处理BPSC 3天，并使用CDX2-mCherry或CDCP1（TSC的表面标志物）进行检测（
(A) EPSC、ESC、TSC、BPSC(EPSC)-TSMD3（来源于EPSC的BPSC经TSM诱导3天）和BPSC(ESC)-TSMD3（来源于ESC的BPSC经TSM诱导3天）中CDCP1阳性细胞比例的代表性FACS分析
(B) 对BPSC-TSC（EPSC）、BPSC-TSC（ESC）和TSC（来源于胚胎）进行免疫荧光染色。检测SOX2和CDX2。比例尺，20 μm。
(C) 采用上述方法制备的E6.5嵌合胚胎的代表性形态学图像（
(D) 经TSM诱导2天分化的BPSC与ESC的E6.5嵌合胚胎形成率。
(E) E12.5时期ESC和BPSC-diff-D2嵌合体的代表性图像。
为探究BPSC的分化潜能
这些结果表明，BPSC在胚内和胚外谱系发育的双向分化潜能方面具有非凡的可塑性。
为探究BPSC的组成，我们收集了scRNA-seq数据，并结合EPSC和ESC进行了统一流形近似与投影（UMAP）分析（
(B) 柱状图显示了在 BPSC、EPSC 和 ESC 中，从 scATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq、H3K27me3 ChIP-seq 和 H3K4me3 ChIP-seq 数据中鉴定出的峰数量。
(C) 堆叠柱状图显示了在 BPSC、EPSC 和 ESC 中，从 scATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq、H3K27me3 ChIP-seq 和 H3K4me3 ChIP-seq 数据中鉴定出的峰在基因组上的分布。
(D) 堆叠柱状图显示了在 BPSC 与 ESC 或 BPSC 与 EPSC 之间鉴定出的上调和下调差异可及性峰的数量。
(E) 基因组浏览器视图显示了 H3K27ac、H3K27me3 和 H3K4me3 组蛋白修饰在……上的分布。
(F) 饼图显示了根据……的表达状态进行分组的 BPSC 的分布。
(H) BPSC、EPSC、ESC 以及植入前小鼠胚胎从合子到 E4.5 囊胚阶段的上胚层（Epi）谱系、滋养外胚层（TE）谱系和原始内胚层（PrE）谱系的代表性基因表达。
(A) BPSC、EPSC 和 ESC 的 scRNA-seq 数据的 UMAP 图。
(C) 热图显示了 BPSC、EPSC 和 ESC 中 TE 和 ICM 标志基因的表达。基因表达经 TPM 标准化并进行对数转换。在 BPSC 与 ESC 或 EPSC 比较中鉴定为差异表达基因（DEG）或无显著差异基因（NS）的基因，其代表性基因显示在热图左侧。
(D) 以 TE 和 ICM 标志基因启动子区域中的峰（±1 kb）为中心的染色质可及性信号热图，展示了 BPSC、EPSC 和 ESC 中的信号分布。每一行对应一个单独的峰，颜色刻度表示归一化后的可及性信号。热图上方的折线图显示了峰周围的平均可及性分布特征。
(E) 基因组浏览器视图显示了代表性 TE 和 ICM 标志基因区域上的染色质可及性信号分布。红色虚线表示 BPSC 与 EPSC/ESC 之间的差异染色质可及性信号。
(F) 基于 BPSC、EPSC 和 ESC 的 scATAC-seq 数据进行的转录因子足迹分析。图中显示了以若干转录因子基序（±250 bp）为中心的归一化 Tn5 插入频率。不同曲线代表不同细胞类型。
(G) 散点图显示了……之间的表达水平。
(H) BPSC、EPSC 和 ESC 以及植入前小鼠胚胎从合子到 E4.5 囊胚阶段的 scRNA-seq 数据的 UMAP 图。
(I) BPSC、EPSC、ESC 以及植入前小鼠胚胎从合子到 E4.5 囊胚阶段的层次聚类分析。
与 FACS 和免疫荧光染色结果相似，单细胞转录组分析显示，约 48% 的细胞共表达……
为了将 BPSC 与植入前胚胎进行比较，我们结合已发表的植入前胚胎数据分析了单细胞 RNA-seq 数据。UMAP 显示，BPSC 与桑椹胚阶段（16 细胞期）的胚胎相似，而该阶段标志着第一次细胞命运决定时期的开始。
为探究AL培养基赋予胚外分化能力的机制，转录组分析显示，在AS、LY或联合处理后，Wnt通路组分显著上调（
(A) ESC、EPSC以及经LY或CHIR处理2天的ESC或EPSC的bulk RNA-seq数据主成分分析（PCA）。
(B) 显示表达水平的柱状图
(C) 在敲低对照和敲低条件下，经AS或LY处理的EPSC中Oct4-GFP阳性和CDX2-mCherry阳性细胞比例的代表性FACS分析
(D) 在敲低对照和Lef1敲低条件下，经AS或LY处理的EPSC的免疫荧光染色。CDX2染色。比例尺，20 μm。
(E) 野生型（WT）和Lef1敲除及敲低桑椹胚与E3.5胚胎的明场图像。
(F) 野生型（WT）和Lef1敲除及敲低胚胎的囊胚形成率。
(G) 野生型（WT）和Lef1敲除及敲低E3.5胚胎的免疫荧光染色。CDX2和SOX2染色。比例尺，20 μm。
(H) 野生型（WT）和Lef1敲除及敲低E3.5胚胎中CDX2和SOX2荧光强度的统计分析。
(I) 热图显示正常囊胚和的bulk RNA-seq中TE及多能性基因的表达
(A) 火山图显示经AS、LY或AS+LY（AL）处理的EPSC与未经处理EPSC之间的差异表达基因（左 panel），以及上调基因的GO富集分析（右 panel）。
(B) EPSC（LCDM）、AS、AS+2.5 μM IWR1、AS+15 μM IWR1、LY、LY+2.5 μM IWR1、LY+15 μM IWR1中Oct4-GFP阳性和CDX2-mCherry阳性细胞比例的代表性FACS分析。
(D) 基于BPSC相较于EPSC或ESC中上调的scATAC-seq峰进行基序分析所鉴定的前5个富集转录因子。
(E) 的转录因子足迹分析
(F) 在敲低对照和敲低条件下，BPSC（AL）中Oct4-GFP阳性和CDX2-mCherry阳性细胞比例的代表性FACS分析
(G) 柱状图显示的bulk RNA-seq数据中若干TE标志基因的表达
(H) 在敲低对照和Lef1敲低条件下，BPSC（AL）的免疫荧光染色。CDX2染色。比例尺，20 μm。
为进一步阐明Wnt信号通路的作用，我们在含有AS和LY的N2B27基础培养基中加入了Wnt抑制剂IWR1。流式细胞术和转录组分析表明，即使低浓度IWR1也能显著抑制AS和LY诱导的CDX2激活，而OCT4表达基本不受影响（
为鉴定负责打破胚外谱系发育边界的下游效应因子，我们分析了来自BPSC、EPSC和ESC的scATAC-seq数据。基序富集分析显示，LEF1和TCF3作为Wnt通路的关键效应因子，是BPSC相较于EPSC或ESC在可及性上调区域中最显著富集的转录因子（
在AL条件下敲低LEF1显著降低了双阳性细胞的比例，并下调了TE谱系基因的表达；转录组学分析以及显示CDX2蛋白水平下降的免疫荧光结果进一步证实了这一点（
鉴于LEF1在双能性中的关键作用，我们随后考察了其对胚胎中首次细胞命运决定的影响。敲除和敲低
在证实BPSC能够高效分化为胚胎及胚外谱系之后，我们进一步探索了其在模拟早期器官发生中的应用价值。值得注意的是，BPSC单独即可形成类囊胚结构（
（C）类囊胚的免疫荧光染色。检测CDX2和OCT4。比例尺，20 μm。
（D）利用BPSC构建胚样结构（embryoid）的示意图。
（E）采用IVC培养基培养4天所构建胚样结构的代表性形态学图像及免疫荧光染色。检测GATA6、OCT4和CDX2。比例尺，100 μm和50 μm。
（F）采用IVC培养基培养5天所构建胚样结构的代表性形态学图像及免疫荧光染色。检测TFAP2C、OCT4和SOX17。比例尺，100 μm和50 μm。
（G）来源于BPSC的第5天胚样结构（右图）与天然E3.5–E6.5胚胎（左图）的UMAP图。
（H）点图显示胚样结构与天然胚胎中谱系特异性标志物的代表性基因表达。
（I）E6.5–7.5样胚样结构的代表性形态学图像。比例尺，100 μm。
（J）E7.5样胚样结构的免疫荧光染色。检测OCT4和T。比例尺，100 μm。
（K）天然E7.5胚胎（上图）与来源于BPSC的E7.5样胚样结构（下图）的UMAP图。
随后，使用该方法培养了E5.5样胚样结构
因此，我们调整了方法：对于起始细胞（EPSC或ESC），一部分先转化为BPSC，再分化为TE样细胞和Epi样细胞；另一部分则直接诱导为PrE样细胞（
（A）的百分比的代表性FACS分析
（B）EPSC及经PrE诱导培养基处理1天的EPSC的免疫荧光染色。检测GATA6、SOX17和OCT4。比例尺，20 μm。
（C）胚样结构自第4天至第8天发育的明场图像。
（D）正常发育胚样结构效率的计算结果。发育良好的胚样结构相对于第4天总聚集体的效率。误差线表示标准误（SE）。
（E）堆叠柱状图显示天然E8.5–E9.0胚胎及来源于BPSC的胚样结构中胚体各类细胞的百分比。
（F）天然E8.5–E9.0胚胎及来源于BPSC的胚样结构中脑相关细胞的UMAP图，按发育阶段着色（左图）或按细胞类型着色（右图）。
（G）天然E8.5–E9.0胚胎及来源于BPSC的胚样结构中心脏相关细胞的UMAP图，按发育阶段着色（左图）或按细胞类型着色（右图）。
(I) 箱线图显示了天然 E8.5-E9.0 胚胎和由 BPSC 衍生的胚样体中 PGC 的 PGC 标志基因表达水平。中心线表示中位数，箱体边界表示四分位距。
(A) 利用 BPSC 构建胚样体的示意图。
(B) 胚样体从第 4 天发育至第 8 天的明场图像。
(C) 第 7 天胚样体、第 8 天胚样体以及天然 E8.75 胚胎的明场图像。天然 E8.75 胚胎来源于在 EUCM 中培养 1.5 天的 E7.5 胚胎。
(D) 天然 E8.5-E9.0 胚胎与由 BPSC 衍生的第 8 天胚样体的 UMAP 图，按发育阶段着色。
(E) 天然 E8.5-E9.0 胚胎（左图）和由 BPSC 衍生的第 8 天胚样体（右图）的 UMAP 图。
(F) 天然 E8.75 胚胎和第 8 天胚样体的免疫荧光染色。SOX1 和 T 染色。比例尺，200 μm。白色虚线框表示尾芽，白色箭头表示脊索。
(G) 天然 E8.75 胚胎和第 8 天胚样体的免疫荧光染色。SOX1 和 MHC 染色。比例尺，200 μm。
(H) 天然 E8.75 胚胎和第 8 天胚样体的免疫荧光染色。SOX2 和 HOXB4 染色。比例尺，200 μm。
P，后部；A，前部；EPC，胚外胎盘锥；Al，尿囊；Am，羊膜；BI，血岛；Fg，前肠窝；H，心脏；NF，神经褶；NT，神经管；YS，卵黄囊。
为确定胚样体中细胞谱系的完整性，我们进行了 scRNA-seq（
免疫荧光结果显示，在第 8 天胚样体中，头部区域形成了神经褶，背部发育出神经管，并逐渐向尾部延伸。神经谱系标志物 SOX1 和 SOX2 的表达水平呈现头部高表达、尾部低表达的模式。从三维重建的组织结构图像中可以清楚观察到，靠近尾部的神经管已经闭合（
第 8 天胚样体已表现出规律性的心脏搏动，对心肌标志物肌球蛋白重链 II 的染色可清晰显示位于胚样体前部的早期心脏结构（
令人惊讶的是，使用带有 ΔPE- 的细胞系
为进一步验证 AL 化学组合在诱导人 BPSC 样状态方面的广泛适用性，我们评估了其在 5i 培养条件下促进人幼稚型胚胎干细胞（nESCs）双向多能性方面的有效性（
(A) 人幼稚型胚胎干细胞（nESCs）经 AL 处理 4 天后的诱导示意图。
(B) 人 nESCs 经 AL 处理后的形态变化。比例尺，200 μm。
(C) 经 AL 处理的人 nESCs 中 OCT4 和 CDX2 表达信号的 FACS 分析。
(D) AL 处理组和 5i 条件下人 nESCs 的 OCT4 和 CDX2 免疫荧光染色。比例尺，50 μm。
(E) 第 4 天 AL 处理组和对照组（Ctrl）人 nESCs 的 UMAP 可视化图。右侧展示了 EPI 特异性基因（POU5F1、DPPA3）和 TE 特异性基因（CDX2、HAND1、KRT8 和 KRT18）的表达。
(F) 气泡图展示了AL处理组与对照组（Ctrl）人nESCs中EPI特异性基因和TE特异性基因的表达情况。
(G) AL处理nESCs与E3至E7阶段天然囊胚单细胞转录组的整合UMAP图，按发育阶段着色。
(H) 包含AL处理nESCs与天然囊胚的整合单细胞转录组UMAP嵌入图，按细胞谱系着色。
(I) 箱线图显示了AL处理人nESCs在不同naïve培养条件和遗传背景下的CDX2表达。
(J) 火山图鉴定了AL处理人nESCs中的差异表达基因。红点表示上调基因，蓝点表示下调基因。
(K) AL处理人nESCs的基因本体论（GO）术语网络分析。
为阐明AL诱导双能性的分子动态机制，我们对第4天的AL处理组和对照组人nESCs进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）（
为进一步验证AL诱导人BPSC样细胞的内在身份及谱系承诺，我们将其映射到人胚胎发育（E3-E7）的单细胞图谱中，方法是与已发表的天然人植入前胚胎数据集进行整合。转录组分析显示，AL处理细胞与胚胎第5至第6天最为接近，整合分析进一步证实这些细胞同时具有EPI和TE特征（
(A) AL处理nESCs与天然囊胚中Epi谱系、TE谱系和PrE谱系的代表性基因表达。
值得注意的是，这种TE预备状态具有一致性，并且不依赖于naïve培养条件或遗传背景，这一点可由多种人nESC系（H9、H1、TJ-1#）中CDX2的稳定激活得到证明（
在胚胎早期发育过程中，从16细胞期到早期囊胚阶段可观察到一过性的CDX2和OCT4双阳性细胞群。
在本研究中，我们通过小分子筛选成功捕获了小鼠和人CDX2与OCT4双阳性细胞，并将其命名为BPSCs。这些细胞在基因表达方面与16细胞期胚胎更为相似，并且能够贡献于胚胎组织和胚外组织。
BPSCs的成功捕获依赖于小分子LY和AS，它们分别作为GSK3和FOXO1的抑制剂发挥作用。已有研究报道，WNT通路可在小鼠和大鼠胚胎干细胞中激活CDX2表达。
BPSCs形成类胚结构，规避了发育研究中胚胎稀缺以及着床过程“黑箱”特性的限制，从而推动了发育生物学领域的发展。此前，类胚结构的构建需要复杂的细胞组合且效率较低。本研究表明，BPSCs可通过改变培养体系形成类似E5.5–E8.5阶段的结构。
总之，我们通过联合使用小分子 AS 和 LY，成功捕获了一种独特的双向发育细胞状态（BPSCs），该状态不同于全能态和多能态。本研究为谱系发育及类胚结构的构建提供了一种有前景的方法。
S.G.、W.L.、Y.W. 构思了该项目并提供指导；K.L.、D.B 和 Y.B. 设计并完成了大部分实验；Z.Y. 提供了生物信息学支持；R.J 和 K.W. 进行了化合物文库筛选；K.L.、D.B.、Z.Y. 撰写了初稿；K.L.、D.B.、Z.Y.、W.L.、J.Y.、S.G. 负责论文的审阅与修改；J.X.、Y.S.、B.D.、X.M.、Z.N.、S.Y.、Y.L.、X.L.、Y.J.、Y.Z.、Y.Z、Y.L.、C.X.、S.L.、S.L.、J.C.、J.Y.、X.K.、Y.Z.、H.W. 协助完成实验。
作者声明不存在竞争性利益。
补充表 1. 小分子及其靶点
补充表 2. sgRNA 与 siRNA 序列
补充视频 1. 卵黄囊中的第 8 天类胚体，具有跳动的心脏
补充视频 2. 切开羊膜后具有跳动心脏的第 8 天类胚体
更多信息以及资源和试剂获取请求应联系并将由通讯联系人 Shaorong Gao 负责提供（
本研究未产生新的独特试剂。
本研究期间产生的 bulk RNA-seq、单细胞 RNA-seq 和单细胞 ATAC-seq 数据可在国家基因组数据中心的 Genome Sequence Archive 获取（
所有动物实验均遵循实验动物使用指南，并经同济大学批准。所有动物均饲养和繁育于中国上海同济大学特定病原体阴性（SPF）动物研究设施中。6–8 周龄的 C57BL/6、ICR、129 小鼠购自北京查尔斯河实验动物有限公司（中国）。在所有器官中稳定表达荧光基因的 B6.Cg-Tg(CAG-GFP)Smoc 小鼠购自上海模式生物研究中心（中国）。携带 △PE- 的 TgOG2 小鼠
小鼠成纤维细胞经丝裂霉素（MMC；Sigma–Aldrich，M0503）处理后作为饲养层用于培养小鼠干细胞，仅少数实验采用无饲养层条件。所有小鼠干细胞均在 37°C、5% CO₂ 的湿润培养箱中培养。
ESC 培养基（ESM）为用于培养 ESC 的基础培养基，成分包括 1 mM L-谷氨酰胺（Millipore，25030–081）、0.1 mM β-巯基乙醇（GIBCO，21985–023）、1× 非必需氨基酸（Millipore，TSM-001-C）、1× 青霉素-链霉素（Thermo Fisher，15140122）、1× 核苷（Millipore，ES-008-D），以及在 DMEM（Sigma–Aldrich，D5671）中加入 15%（v/v）胎牛血清（FBS）（HyClone，SH30070.03）。
在本研究中，ESC 在补充有 2i/LIF 的 ESM 中培养（1 mM MEK 抑制剂 PD0325901，Selleck，1036S；3 mM GSK-3 抑制剂 CHIR99021，Selleck，S2924；以及 10 ng ml
EPSC 在 EPSC 培养基中培养，该培养基已在已发表研究中描述。
BPSC 在 N2B27 基础培养基中培养，并补充 10 nM LY2090314（MedChem Express，HY-16294）和 0.6 μM AS1842856（MedChem Express，HY-100596）。
TSC按照已发表研究中描述的方法，在TSC培养基（TSM）中培养。
PrE诱导培养基由N2B27基础培养基组成，并补充2.5 μM 1-Azakenpaullone（Selleck Chemicals，S7193）、100 ng/mL重组人FGF4（PeproTech，100–31）、0.2 μM TTNPB（Selleck Chemicals，S4627）和1 mM 8Br-cAMP（Selleck，S7857）。
BPSC来源于桑椹胚（16至32细胞期），其获取自
初始态人PSC维持于5iLAF培养基中，该培养基由naïve基础培养基组成，包含DMEM/F12:Neurobasal（1:1）（Thermo Fisher）、1% N2添加剂（Thermo Fisher）、2% B27添加剂（Thermo Fisher）、0.5% KnockOut SR（Thermo Fisher）、1%非必需氨基酸（Millipore）、2 mM GlutaMAX（Millipore）以及青霉素-链霉素（Millipore），并加入1 μM PD0325901（Selleck）、0.5 μM SB590885（Selleck）、1 μM WH-4-023（Selleck）、1 μM IM12（Selleck）、10 μM Y-27632（Selleck）、20 ng/ml activin A（PeproTech）、20 ng/ml人LIF（Millipore）、8 ng/ml bFGF（PeproTech）和50 μg/ml BSA（Sigma-Aldrich）。
4CL培养基由Neurobasal培养基（Gibco，21103049）与Advanced DMEM/F12（Gibco，12634028）按1:1混合组成，并补充1% N2（Gibco，17502048）、2% B27（Gibco，17504044）、1 mM丙酮酸钠（Corning）、非必需氨基酸（Corning）、1 mM GlutaMAX（Gibco）、青霉素-链霉素（Millipore）、10 nM DZNep（Selleck）、5 nM TSA（Selleck）、1 μM PD0325901（Selleck）、5 μM IWR-1（Selleck）、20 ng/ml人LIF（Peprotech）、20 ng/ml activin A（Peprotech，120-14E）、50 μg/ml L-抗坏血酸（Sigma）以及0.2%（v/v）Matrigel。
初始态细胞每4–7天使用Accutase（Sigma-Aldrich）传代一次。所有人细胞系均在5% O
为进行诱导，在5iLAF或4CL中补充10 nM LY（MedChem Express）和0.6 μM AS。
对于BPSC的自主分化
BPSC通过将BPSC接种于培养板中，并在不含诱导因子的TSM基础培养基中培养2天获得。
BPSC在含25 μg/mL FGF4和1 μg/mL肝素的TSM中分化3天后，收集CDX2-mCherry阳性或CDCP1（R&D Systems AF4515-SP）阳性细胞进行FACS分选。多向分裂细胞以TSM诱导2天后用于嵌合体实验。
嵌合体通过将分化细胞和ESC显微注射到正常供体8细胞期胚胎中构建。构建后的嵌合体在G-1 PLUS（Vitrolife 10128）培养基中培养，并于E3.5囊胚期移植入假孕2.5天受体子宫内。
2细胞期受体胚胎从交配后的ICR雌鼠输卵管中收集，并在矿物油覆盖条件下于37°C、5% CO条件下在G-1 PLUS培养基中培养。
将10–15个单细胞转移至聚合板的凹孔中。将“四细胞期”四倍体胚胎的透明带用20 mg/mL PE（Pronase E；Sigma，#P8811）消化，每组在一个凹孔中放置2枚胚胎。聚合胚胎在G-1 PLUS培养基中培养至囊胚期，随后于假孕受体2.5 dpc时移植入子宫。
对于小干扰RNA（siRNA）转染，首先将Lipofectamine RNAiMAX试剂（Invitrogen，货号13778100）稀释于Opti-MEM低血清培养基（GIBCO，货号31985070）中。随后，将稀释后的试剂与分别用相同培养基稀释的siRNA混合。该混合液在室温下孵育15分钟，以形成转染复合物。孵育结束后，将转染复合物逐滴加入细胞培养体系中。在该培养条件下继续培养细胞48小时，以保证siRNA介导的基因敲低具有足够的作用时间。48小时孵育结束后，收集细胞用于后续实验检测。
本研究中所使用的siRNA序列列于表S1。
我们构建了胚胎样结构，所采用的IVC和EUCM培养体系遵循既往报道的方法。
首先，将起始细胞EPSC或ESC分为两部分。其中一部分先转化为BPSC，随后转入TSM中培养2天。另一部分在PrE诱导培养基中培养1天（EPSC）或2天（ESC）。随后，将细胞消化为单细胞，并按每孔43,200个细胞的接种量铺入AggreWell中（其中TS诱导细胞35,200个，PrE诱导细胞8,000个）。第1天，使用FM与N2B27基础培养基按1:1配制的混合培养基，并加入10 μM Y27。次日，继续使用不含Y27的新鲜混合培养基培养。第3天，每孔更换1.5 mL IVC2。
第4天，将所有聚集体转移至超低吸附6孔板中，在摇床条件下（转速70 rpm）继续使用IVC2培养1天（每孔3 mL）。第5天，将形态良好的类胚体转移至EUCM中，在静置培养条件下培养1天。随后3天，在滚瓶培养条件下培养类胚体（转速30 rpm，Eastmo biotech Ltd，WEC001-GT4），每日更换新鲜EUCM，并在最后1天额外加入3 mg/L葡萄糖。
FM由DMEM组成，含15%（v/v）胎牛血清（FBS）、1 mM L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青霉素-链霉素和1×丙酮酸钠。IVC2由CMRL 1066（Thermo Fisher Scientific，11530037）组成，含20%（v/v）FBS、1 mM丙酮酸钠、1×青霉素-链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、1× N2补充剂和0.25× B27补充剂。
EUCM由25%（v/v）DMEM（Sigma-Aldrich，D5671）或DMEM/F12（GIBCO，11330–032）、25%（v/v）成人人血（Sigma-Aldrich，H4522-100ML）、50%大鼠血清（Charles River）、1 mM丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、1×青霉素-链霉素和2 mM L-谷氨酰胺组成。
将6000–12000个细胞置于24孔Aggrewell-400（STEMCELL Technologies，34415）板的一个孔中，并使用blastoid培养基进行培养。
Blastoid培养基由25% TSC基础培养基、25%（v/v）N2B27基础培养基和50%（v/v）KSOM（艾贝生物，M1430）或G-1 PLUS组成，并补充2 µM ROCK抑制剂Y-27632（Selleck，S049）、12.5 ng/mL重组人FGF4、0.5 µg/mL肝素（Sigma-Aldrich，H3149）、3 µM CHIR99021、5 ng/mL重组人BMP4（PeproTech，12–05ET）以及0.5 µM A83–01（Axon Medchem，1421）。
次日将培养基更换为不含Y-27632的新鲜培养基。
在进行免疫荧光染色之前，所有细胞克隆和胚胎均需用4%多聚甲醛（Servicebio，中国）于4°C固定24 h。固定后，包括桑椹胚、囊胚和E6.5胚胎、细胞集落及E5.5样胚状体在内的样品于室温下用通透化试剂孵育30 min。通透化试剂由DPBS（Gibco）中的0.3% Triton X-100（Sigma-Aldrich，93443）配制而成。随后，细胞集落于室温下用含3%牛血清白蛋白（BSA，MP Biomedicals）的DPBS封闭液封闭1 h。
不同于细胞集落，胚胎和E5.5样胚状体需在室温下使用含0.5% Triton X-100和3% BSA的DPBS进行通透和封闭2 h。一抗用封闭液稀释后，与样品于4°C孵育过夜。经含0.01% Triton X-100的DPBS洗涤3次后，二抗用3% BSA-DPBS稀释，并于室温下与样品孵育2 h。细胞核使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Invitrogen，D3571）于室温下染色15–20 min。细胞核染色后，使用DPBS洗涤样品。
完成免疫荧光染色的样品使用ZEISS LSM 880共聚焦显微镜进行拍摄和处理。
我们将胚样体从羊膜中切出，置于4%多聚甲醛中，并于4°C过夜固定。在一抗孵育前，我们使用动物组织透明化试剂盒（Beyotime，P0112L）对胚样体进行透明化处理。随后，按照上述方法进行免疫荧光染色，并将二抗和DAPI的孵育时间加倍。完成免疫荧光染色的样本使用Olympus FVMPE-RS显微镜进行拍摄和处理。
所用一抗及其稀释比分别如下：小鼠抗CDX2（1:400；Bio-Genex，MU392A-UC）、抗OCT4（1:200；Santa Cruz，sc-5279）、抗GATA6（1:200；R&D Systems，AF1700）、抗SOX2（1:200；R&D Systems，AF2018-SP）、抗Brachyury（1:200；R&D Systems，AF2085-SP）、抗TFAP2C（1:200；Santa Cruz，sc-12762）、抗SOX17（1:200；R&D Systems，AF1924-SP）、抗SOX1（1:200；Cell Signaling Technology，4194S）、抗MHCII（1:200；R&D Systems，MAB4470-SP）、抗HOXB4（1:100；Abcam，ab133521）、抗TPBPA（1:500；Abcam，ab104401）。
二抗购自Thermo Fisher的Alexa Fluor®系列，稀释比例为1:200。
细胞经0.05%胰蛋白酶-EDTA消化后，用补充2% FBS的DPBS清洗。使用抗CDCP1（1:50；R&D Systems，AF4515-SP）或抗PDGFRα（1:200；Abcam，ab203491）抗体染色后，细胞经清洗并重悬于补充2% FBS的DPBS中。
进行了高通量筛选，使用
经72小时孵育后，细胞用4%多聚甲醛（PFA）固定20 min，随后用DAPI对细胞核进行染色。采用Operetta CLS系统（PerkinElmer，USA）进行高内涵成像，并使用Harmony 4.0软件（PerkinElmer，USA）进行图像分析。
将35 mm培养皿中汇合度达80%的细胞用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化。经DPBS清洗后，将细胞收集于含有1 mL TRIzol（Takara Bio，9109）的1.5 mL离心管中。涡旋振荡5 min后，细胞可转移至−80 °C保存，直至提取RNA。采用酚-氯仿提取法提取总RNA。使用KAPA Stranded mRNA-Seq Kit（KAPA，KK8421）构建bulk mRNA-seq文库。
构建完成的mRNA-seq文库在Illumina Novaseq 6000平台上进行150 bp双端测序。构建文库的测序和质量控制由南京江北新区生物医药公共服务平台完成。
细胞经0.05%胰蛋白酶-EDTA消化后，用补充0.04% BSA的DPBS清洗3次。胚样体使用accumax（Sigma-Aldrich，A7089-100ML）与胶原酶（Thermo Fisher Scientific，17104019）按1:1比例配制的混合液于室温下消化10–20 min。用于scRNA-seq的样本应满足细胞活率大于80%、团聚率低于20%。
单细胞RNA文库采用10× Genomics Chromium Next GEM Single Cell 3’ Kit v3.1（16 rxns，PN-1000268）和MGI DNBelab C RNA Library V2.0构建。文库在Illumina Novaseq X Plus和MGI DNBSEQ-T7平台上进行测序。
对于bulk RNA-seq数据分析，我们使用软件Trim Galore v0.6.10进行接头去除。随后，采用STAR 2.7.10b将数据比对至小鼠参考基因组mm10。基因表达矩阵使用FeatureCounts v2.0.3生成。差异表达基因的计算及主成分分析（PCA）使用DESeq2 v3.4.1软件包完成。当 |log2（倍数变化）| > 0.5 且校正后 P < 0.05 时，基因被认为具有显著性。对于GO分析，我们使用了Metascape（
为了获得基因表达矩阵，使用CellRanger v7.1.0分析scRNA-seq FASTQ文件（
使用Cellranger ATAC v2.1.0分析scATAC-seq和FASTQ文件（
ChIP-seq分析按照标准流程进行
为了构建小鼠早期胚胎的发育轨迹，我们收集了bulk RNA-seq数据集GSE66582
本研究生成的bulk RNA-seq、ChIP-seq、单细胞RNA-seq和单细胞ATAC-seq数据可在国家基因组学数据中心Genome Sequence Archive获取（
本研究主要得到国家重点研发计划（2021YFA1102900和2022YFC2702200）以及国家自然科学基金（32488101、32330030、82301921、32070823、92168205、32270909、82201881、92168205、31871448、31820103009、82022027、32300684和32400677）的资助。
本研究还得到上海市科学技术委员会重点项目（19JC1415300和21JC1405500）、上海市自然科学基金（21ZR1450700）、中国博士后科学基金（2023M732660、2023M732661）、中国博士后科学基金会博士后创新人才支持计划（GZB20230523）、上海基础研究先行区计划、上海市博士后卓越计划（2022521、2022551）、深圳医学研究专项资金（B2402013）、中央高校基本科研业务费专项资金（项目编号：22120240435）、上海市高等学校高峰学科（IV类）以及教育部的支持。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.06.28.662107
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