顶端-基底极性的建立与维持是脑发育中的一个基础步骤，指导神经祖细胞（NPCs）以及发育中大脑皮层的组织构建。尤其是，位于基底侧的细胞外基质（ECM）对这一过程至关重要。在体外， epithelial 极化可通过内源性 ECM 产生或外源性 ECM 补充来实现。尽管大脑类器官能够重现神经上皮发育，但不同 ECM 来源对组织形态发生的影响仍未得到探究。在此，我们表明，在神经上皮早期阶段暴露于外源性 ECM 会导致组织快速极化，并在 3 天内引发神经上皮结构的完全重排。
在未暴露的培养条件下，NPCs 通过内源性 ECM 的产生，在较长时间内逐步获得极性。神经发生启动后，组织结构和神经元分化在很大程度上独立于初始 ECM 来源。这些结果增进了对体外神经上皮生物学的认识，重点关注外源性与内源性引导的形态发生机制。研究结果表明，神经上皮培养可通过内源性过程实现自我维持，这促使人们迫切重新评估在这些模型系统中不加区分地使用外源性 ECM 的做法。
上皮形态发生是包括脑在内的多个器官发育过程中的关键步骤（
极化过程依赖于邻近细胞与细胞外基质（ECM）蛋白所介导的协调信号。特别是，基底膜蛋白是与细胞表面相关的 ECM，排列于上皮组织的基底表面，提供启动并维持极性的线索（
神经上皮生成、形态发生和分化的关键特征可通过脑类器官这一发育中人脑区域的三维模型得以重现（
在本研究中，我们考察了人端脑类器官发育过程中不同外源性 ECM 暴露方式的影响。我们采用了 Matrigel，这是一种从小鼠 Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤中提取的 ECM 制剂（
为评估 ECM 补充如何影响类器官早期发育，我们在神经上皮化开始时（第 10 天，D10）以 Matrigel 形式提供外源性 ECM（exECM）。Matrigel 的施加方式包括：作为固体液滴提供对聚合化 ECM 蛋白网络的长期暴露（液滴包埋，exECM
所采用的三种类器官方案总结（见材料与方法）、分析时间点以及相关发育里程碑。共同来源的一批胚样体（EBs）在 D10 被分配至三种实验条件：包埋于 Matrigel 液滴中（exECM
为评估类器官发育、生长和形态的一般特征，我们采用了纵向明场显微成像（
不同细胞系之间具有可比性的形态学变化包括：D10 时外层变亮、exECM 条件下的组织出芽
为了解外源性 ECM 暴露是否会改变神经上皮形态，我们评估了神经祖细胞的早期组织情况。为了可视化组织内单个 NPC 的位置，我们使用了 H9 衍生的报告细胞系，其中绿色荧光蛋白的表达由 SOX2 启动子驱动（SOX2::SOX2-p2A-EGFP，下文简称 SOX2::EGFP），以标记真正的神经祖细胞（
采用由 80% WT H9 ESC 和 20% SOX2::EGFP 组成生成的类器官，在 D10 时用于可视化单个神经祖细胞
在 D10 时，整个 EB 组织中均可见小的中空区域——空腔形成位点——提示结构不对称性的初始发生点（
顶端域和基底域分别由 PKCζ 和 FN 标记。在 exECM 中，于 D13 建立了顶端向内/基底向外的极性轴
为了理解驱动 NPC 极化时间进程的因素，我们评估了 PKCζ 和纤连蛋白（FN）的位置，它们分别是顶端域和基底域的标志物（
顶端域和基底域分别由 PKCζ 和 FN 标记。在 exECM 中建立了顶端向内/基底向外的极性轴
顶端域和基底域分别由 PKCζ 和 FN 标记。在所有条件下均建立了顶端向内/基底向外的极性轴。底部面板：插图区域放大图。
发育中脑内存在的若干 ECM 蛋白
为了评估神经上皮形成初始差异是否会影响神经祖细胞与神经元的相对组织，我们在神经发生阶段对类器官进行了评估。无论是否暴露于外源性 ECM，最早出现的神经元（MAP2
所有条件和细胞系来源的类器官均显示出丰富的、具有 PKCζ 标记的神经玫瑰花样结构
（A）D40 时组织结构的示意图。可见大量神经玫瑰花样结构以及较小的视杯组织区域。（A’）背侧皮层玫瑰花样结构组织的示意图。（B）所有条件下的类器官均显示出丰富的、具有 PKCζ 标记的神经玫瑰花样结构
由方案变异性或非期望外源性线索导致的组织错误模式化，可能会造成类器官内出现不希望出现的区域命运。在检查 D40 时类器官形态的过程中，我们识别出了一些未组织成神经玫瑰花样结构的区域，这些区域表现得更加迂曲和无序（
类器官建模的主要目标之一，是获得发育中神经组织的成熟特征。因此，为了评估早期差异性暴露于外源性 ECM 对类器官成熟的潜在长期影响，我们在不同类型成熟神经元已出现的发育阶段（D120）研究了类器官的细胞组成。值得注意的是，尽管到这一时间点类器官组织已完全长出早期添加的 exECM，Matrigel 在 exECM 中仍可见为大的实性团块
UMAP 投影中的无监督聚类鉴定出两个主要簇（
为了验证所有细胞系和条件下的细胞类型组成，我们采用了免疫染色（
上皮形态发生涉及多个过程的连续协调，包括由细胞-细胞外基质（ECM）和细胞-细胞相互作用介导的组织极化，以及腔的形成、维持和扩张（
在此，我们表征了外源性ECM是否存在如何影响人端脑类器官的发育。我们发现，在缺乏外源性ECM（exECM）的情况下，早期空泡化位点会启动组织不对称性，并且很可能是玫瑰花结腔的起始点。这些观察提示了一种类似于继发性神经胚形成的机制
尽管极化和腔形成会自发出现
另一个重要结论是，以凝胶化基质形式存在的Matrigel暴露（exECM
其他研究也已探讨内源性和外源性ECM来源对上皮形态发生的影响
从深层神经元产生高峰期（D40）到类似晚期皮质发生的阶段（D120），类器官发育在很大程度上以相似方式进行，而不受早期外源性ECM暴露的影响。在所有条件和hPSC遗传背景下，组织均组织为神经玫瑰花结，具有可比的背侧皮质身份、由内向外的祖细胞与神经元组织结构，以及顶端-基底极性轴。神经祖细胞（NPC）首先产生CTIP2
在本研究中，我们探讨了在神经上皮形成阶段，使背侧端脑脑类器官暴露于外源性ECM制剂Matrigel的影响。我们对类器官组织早期阶段进行了详细的形态学分析，主要聚焦于顶端-基底极性和ECM组成，但并未探究玫瑰花结组装的确切分子机制。未来，结合对早期阶段来源于镶嵌报告PSC的类器官进行活体成像，开展对空泡化和极化过程更为详细的生物化学表征，以可视化组织形态发生，将是很有意义的。此外，我们选择使用Matrigel，因为它是大脑类器官领域中外源性ECM的金标准。
然而，Matrigel含有成分未完全明确的ECM组分和生长因子混合物，这给实验结果的解释带来了挑战。事实上，尽管我们提出Matrigel来源的层粘连蛋白（Laminin）很可能参与极性建立，但我们无法精确确定在暴露培养中引起所观察效应的具体成分。例如，在exECM中观察到的组织图式化效应
在类器官培养中补充外源性ECM已相当普遍，但对于某些
本研究中讨论的scRNAseq数据已存入NCBI的基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，
概念构思：CMC、NSC、JS、JAK；方法学：CMC、VP、AP、PM；正式分析与研究：CMC；论文撰写—初稿准备：CMC；论文撰写—审阅与编辑：CMC、NSC、JS、JAK；经费获取：JAK；资源提供：JAK；监督：NSC、JS、JAK。
J.A.K. 是一项描述大脑类器官技术的专利发明人，并且是 a:head bio AG 的联合创始人及科学顾问委员会成员。
无饲养层 hESC 细胞系 WA09（H9 ESCs）购自 WiCell；iPSCs#1 和 iPSCs#2 为本研究内部由健康供体成纤维细胞重编程获得（内部命名分别为：iPSCs 178/4 和 iPSCs 176/1）；iPSCs#3 为购自 HipSci 的 Rozh-5 iPSCs。因此，我们使用了一种非常常见的 ESC 细胞系，以及商业可得和内部重编程获得的 iPSC 细胞系。
所有细胞均培养于包被有 hESCs 级 Matrigel（Corning，354277）的 6 孔板（Corning，3516）上，并维持于完全 mTeSR1 培养基（StemCell Technologies，85875）中。细胞每日用 2 mL mTeSR1 换液（使用 4 mL 喂养时可每周跳过一天换液），并在汇合度达到 60–80% 时传代（每 3–5 天一次）。传代时，细胞暴露于用 PBS 稀释的 0.5 mM EDTA 中（pH 7.4，不含 MgCl
背侧前脑富集的端脑类器官按照先前报道的方法并稍作修改生成（
在第 10 天，成功形成超过 80% EBs 的批次被保留用于后续实验。质量标准包括：EB 直径大于 500 μm、形态圆整，以及出现外围组织透明化，这表明神经上皮形成已经开始。符合这些标准的批次在 D10 被随机分为三组，分别接受不同条件的外源性 ECM（exECM）补充。各条件的具体处理方法如下所述。
值得注意的是，在成功的批次内，所有条件下类器官质量均具有可比性，因此其质量很可能由 Matrigel 暴露之前或独立于其作用的因素所决定，例如起始 hPSC 群体的多能性状态、汇合度和传代次数，以及研究人员在 EB 建立阶段的操作技术。
在第 13 天，NI 培养基被更换为不含维生素 A 的分化培养基（Diff-A，
在第 20 天，所有类器官无论 Matrigel 条件如何，均转移至 10 cm 培养皿中，并置于轨道振荡器（Celltron）上以 57 rpm 的转速培养。在第 25 天，培养基更换为含维生素 A 的分化培养基（Diff+A，
在使用时，外源性 ECM 为 LDEV-Free Matrigel（Corning，354234）。
在 D10，EB 保持于 96 孔板中，并按照上述时间表每日更换培养基。例外情况出现在周末，此时通常会跳过一天喂养；以及在 CHIR99021 脉冲处理期间，培养基更换严格发生于 D13 和 D14，而非 D16。
在 D10，按照先前报道的方法，EB 被包埋于铺设在带凹点的封口膜片上的 Matrigel 液滴中（
在 D10，培养基（NI）中补充 Matrigel 至终浓度 2% V/V。随后在 D13 的下一次喂养时不再加入 Matrigel。
类器官于第10、13、16、20、40和120天收集，并在室温（RT）下用4%多聚甲醛（PFA）固定30 min（D10-D20）或1–2 h（D40-D120）。经PBS清洗3次，每次15 min后，将类器官浸入15%蔗糖（Merck Millipore，84097）/10%明胶（Sigma，G1890-500G）溶液中，于37 °C孵育，直至其沉至管底（1 h至过夜不等）。
随后将类器官包埋于相同的蔗糖/明胶溶液中，在4 ºC下凝固30 min，并在由干冰冷却至−50 °C的2-甲基丁烷浴中快速冷冻。样品储存于−70 ºC，直至后续处理。冷冻包埋块使用冷冻切片机（Thermo Fisher Scientific，CryoStar NX70）切制为厚度20 μm的切片。
载玻片在PBS中解冻并水化5 min后，使用封闭液〔PBS中含5%牛血清白蛋白（BSA；Europa Bioproducts，EQBAH-0500）和0.3% Triton X-100（Merck Millipore，93420）〕于RT下对冷冻切片进行透化和封闭1–2 h。抗体孵育采用抗体溶液〔PBS中含1% BSA和0.1% Triton X-100〕；抗体稀释后，将溶液以最高转速离心2 min。首先，将切片置于含1:200稀释一抗的抗体溶液中，于RT孵育3.5 h（最长可至过夜）。
随后，经PBS清洗1次，5 min后，将切片置于含1:500稀释二抗和1:10,000稀释Hoechst 33342核染料（Thermo Fisher Scientific，H3569）的抗体溶液中，于RT孵育1–2 h。本研究中使用的一抗和二抗汇总于
D10至D20类器官的免疫染色图像使用正置式LSM 800共聚焦显微镜（Zeiss）获取。D40和D120类器官的免疫染色图像使用Pannoramic FLASH 250 II数字切片扫描仪（3DHISTECH）获取。完整类器官的明场图像见
使用Fiji软件中的直线工具对明场图像中的类器官直径进行测量。当类器官呈现非圆形（如椭圆形）形态时，测量其最大尺寸。定量数据矩阵在R软件v4.2.2中使用dplyr（v1.0.9）进行处理，并使用ggplot2（v3.4.0）进行可视化。为便于展示生长动态，在图中添加了趋势线，采用平滑条件均值函数（ggplot2::geom_smooth，formula = ‘y ~ x’）。
类器官、玫瑰花环结构和OTX2的界定
用于 scRNAseq 的类器官经收集后，使用两个 P10 移液器吸头切成 2 或 3 块，并用 DPBS-/- 清洗。
每个单独的类器官在 gentleMACS Dissociator（Miltenyi Biotec，130-093-235）中，采用 NTDK1 程序，于含有 Trypsin（Thermo Fisher Scientific，15400054）/Accutase（Sigma-Aldrich，A6964）（1:1）以及 1 μL/mL TURBO™ DNase（Thermo Fisher Scientific，AM2238，2 U/μL）的 1.5 mL 消化液中孵育。
含有解离细胞的离心管经短暂离心后，向解离细胞中加入 1.5 mL 缓冲液〔冰冷的 DPBS-/-（Thermo Fisher Scientific）和 0.1% BSA（Sigma-Aldrich）〕。细胞悬液于 4 ºC、400 g 条件下离心 5 min。吸弃上清，保留约 200 μL 余量，并将细胞重悬于 700 μL 缓冲液中。悬液先经 70 μm 滤网过滤一次，再经 FACS 管盖过滤两次。
加入活性染料 DraQ7（Biostatus，DR70250，0.3 mM），终浓度为 20 μL/mL，并使用 P1000 移液器轻柔混匀悬液。采用 100 μm 喷嘴对每个单独类器官的 250k 个活细胞进行 FACS 分选；单细胞基于前向散射和侧向散射进行门控，活细胞则基于 Alexa 700 滤光片下无激发信号进行门控。
采用 10X Genomics 3’ CellPlex Kit，按照制造商方案，使用独特的 Cell Multiplexing Oligo（CMO）对每个单独类器官进行多重标记，但缓冲液配方以及 400 g 离心步骤采用上述条件。
多重标记后，对每个类器官的活细胞进行计数，并按相同数量混合，归一化至活细胞数最低的类器官。最终混合样品经离心后重悬于小体积中，并再次对活细胞进行计数。制备了两个文库，分别在 Chromium Single Cell 3’ B Chip（10X Genomics，PN-1000073）的每个通道中加载 40k 和 50k 个活细胞（预估每个通道回收 10k 个细胞），并通过 Chromium controller 处理以生成单细胞 GEMs（Gel Beads in Emulsion）。
scRNAseq 文库采用 Chromium Single Cell 3’ Library & Gel Bead Kit v.3（10x Genomics，PN-1000075）制备。
两个文库在 NovaSeq S4 flowcell（Illumina，与其他样本共同上机）中混合，并进行双端测序。
scRNAseq 测序读段使用 Cell Ranger multi v6.0.1（10X Genomics）进行处理，采用预构建的 10X GRCh38 参考基因组 refdata-gex-GRCh38-2020-A，并包含内含子。scRNAseq 数据的进一步处理，如降维、聚类和可视化，在 R 软件 v4.2.2 和 Seurat v4.2.0 中完成。两个文库之间未检测到批次效应，因此联合处理。
在聚类分辨率 0.1（“FindClusters”）下分离非端脑细胞。基于 FOXG1 表达缺失或低表达，去除非端脑细胞簇（簇 3、5 和 6）以进行后续分析。
在排除非端脑细胞后，我们使用 Gruffi 算法识别并去除呈现细胞应激转录特征的细胞（
在分辨率 1 和 0.5 下进行聚类，基于已知标志基因的表达，获得了按细胞类型最可靠的分离结果：增殖中的 NPC 和 RG（分辨率 1 下的簇 3、5、7、8、12）、OPC（分辨率 1 下的簇 10）、IN（分辨率 1 下的簇 9）、IPC（分辨率 1 下的簇 4）、未成熟兴奋性神经元（分辨率 1 下的簇 0、1 和 2；以及分辨率 0.5 下的簇 0 和 6）、ExNs DL（分辨率 0.5 下的簇 1）和 ExNs UL（分辨率 1 下的簇 6 和 11）。
使用统一流形近似与投影（UMAP）（uwot v0.1.14）生成二维表示。定量数据矩阵在 R 软件 v4.2.2 中使用 dplyr（v1.0.9）进行处理，并使用 ggplot2（v3.4.0）进行可视化。
常规单因素方差分析（ANOVA）；0 ≤ p < 0.001，***；0.001 ≤ p < 0.01，**；0.01 ≤ p < 0.05，*；p ≥ 0.05，ns。Drop，exECM
常规单因素方差分析（ANOVA）；0 ≤ p < 0.001，***；0.001 ≤ p < 0.01，**；0.01 ≤ p < 0.05，*；p ≥ 0.05，ns。Drop，exECM
常规单因素方差分析（ANOVA）；0 ≤ p < 0.001，***；0.001 ≤ p < 0.01，**；0.01 ≤ p < 0.05，*；p ≥ 0.05，ns。Drop，exECM
神经诱导培养基（NI）、不含维生素 A 的分化培养基（Diff-A）以及含维生素 A 的分化培养基（Diff+A）500 mL 配方的培养基成分及配制方法。
我们感谢 Oliver Eichmüller 在分析方面提供的帮助，并感谢 Knoblich 实验室成员对手稿提出的反馈意见。我们感谢 IMBA 干细胞核心平台提供细胞重编程服务；IMBA/IMP/GMI BioOptics 平台提供显微成像服务；以及 IMBA/IMP/GMI 生物信息学平台提供测序分析。
Knoblich 实验室的工作得到奥地利科学院、奥地利科学基金（FWF）（专项研究计划 F7804-B 及独立项目资助 P 35680 和 P 35369）、奥地利联邦教育、科学与研究部、维也纳市，以及欧洲研究委员会（ERC）根据欧盟“地平线 2020”计划提供的高级资助项目（编号 695642 和 874769）的支持。
JS 获得 EMBO 长期奖学金（EMBO ALTF 794-2018）以及欧盟“地平线 2020”研究与创新计划项下 Marie Skłodowska-Curie 奖学金协议 841940 的资助。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.12.06.519271
🏷️ 端脑类器官 细胞外基质 神经上皮极化 形态发生 神经祖细胞