由干细胞生成的类胚胎结构能够达到不同程度的发育里程碑，但尚无研究表明其能够经历原肠胚形成、神经胚形成和器官发生的完整过程。
在自然发育过程中，合子发育形成三种初始谱系：上胚层（epiblast），其将形成机体本身；胚外内脏内胚层（VE），其参与卵黄囊形成；以及胚外外胚层（ExE），其参与胎盘形成。来源于这些谱系的干细胞提供了一种可能性，即不再依赖单个全能性合子，而是从多个组分完全再生哺乳动物个体。
来源于上胚层的胚胎干细胞（ESCs）在聚集后表现出形成类胚胎结构的显著能力。例如，包埋于Matrigel中的ESC聚集体（“gastruloids”）可形成具有体干样结构的组织，其中包含体节、神经管和肠道。
起源于胚外组织的信号对于多能性上胚层的图式化以及前后轴的建立至关重要。基于自然发育中对胚外细胞这一需求的认识，我们通过将ESCs与来源于ExE前体的滋养层干细胞（TSCs）以及来源于VE前体的胚外内胚层干细胞（XEN）聚集，构建了合成胚胎。
上述所有策略的一个局限在于，未能准确再现自然胚胎的发育过程；而自然胚胎会经历上皮—间充质转化、原肠胚形成、器官发生以及前脑结构的发育。在此，我们确定了能够使ETiX胚胎重现原肠胚形成及自然着床后发育至胚胎第8–8.5天条件。此类ETiX胚胎具有前脑和中脑区域、有序的神经管、搏动的心脏以及肠管。神经管两侧伴有发育中的体节，并且我们观察到尾部区域原始生殖细胞的形成。上胚层的这些结构位于胚外卵黄囊内部，而该卵黄囊启动了血岛发育。
据我们所知，ETiX胚胎是迄今为止在所有干细胞来源体系中发育潜能最大且生理相关性最高的体系。
为确定支持ETiX胚胎形成前脑结构的条件，我们按照先前所示的方法接种ESCs、TSCs和iXEN细胞。
ETiX胚胎能够忠实重现天然小鼠胚胎的发育。
我们还通过检测基因表达变化对发育过程进行了监测。具体而言，我们分别分离了第5天、第6天和第8天的单个ETiX胚胎，以及E6.5、E7.5和E8.5阶段的天然胚胎，将其解离为单细胞并进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。UMAP分析显示，在天然胚胎与ETiX胚胎中，细胞对各发育谱系的贡献具有相似性。
天然胚胎和ETiX胚胎在上胚层不同胚层（外胚层、中胚层、内胚层）之间，以及胚胎谱系与胚外谱系（上胚层、胚外外胚层、胚外中胚层和胚外内胚层）之间的细胞分布总体上表现出高度保守性（
在自然发育过程中，上胚层前侧保持其上皮特征，自E8.0起上调神经外胚层标志物Sox1的表达，并开始形成神经系统。神经外胚层谱系产生前脑、中脑、后脑和脊髓。
为考察神经发育，我们通过免疫荧光分析了公认的神经外胚层标志物的表达。在ETiX第7天胚胎中，Sox1和Sox2在神经上皮细胞群中沿整个前后轴表达，其模式与天然E8.0胚胎相似（
转录因子Otx2参与中脑和前脑的模式形成
接下来，我们利用scRNA-seq数据考察了以下关键标志物的表达：1）神经外胚层，其产生神经系统；2）表面外胚层，其产生大多数上皮组织；3）脊索，其对神经外胚层和神经管的模式形成至关重要；4）上胚层，其是所有这些组织的前体。在ETiX胚胎和天然脊索中，我们观察到FoxA2、Chordin和Shh具有可比的表达（
与神经系统相关的缺陷是人类中第二常见的发育异常
在自然胚胎发生过程中，神经中胚层祖细胞（NMPs）对神经管和轴旁中胚层的衍生组织均有贡献
轴旁中胚层进一步形成体节，体节是沿发育中胚胎前后轴形成的成对细胞块，是骨骼肌、血管和皮肤节段性形成所必需的
另一组注定形成心脏的细胞也在原肠胚形成期间自原条中出现。在天然小鼠胚胎中，这一显著的发育事件发生于约E8.0，此时随着心脏中胚层分化为心肌细胞，心跳得以建立。我们在ETiX第8天胚胎中观察到在脑区下方形成了搏动结构（补充视频1）。肌球蛋白重链II（Myh2）和转录因子Gata4对心脏发育是必需的，我们发现该搏动区域表达Myh2和Gata4（
来自中胚层及其衍生物的 scRNA-seq 数据证实并扩展了我们从免疫荧光实验中获得的发现。导向体节形成的基因表达特征在 ETiX 胚胎中是明显存在的，尽管前体节身份基因（Tbx6、Hes7 和 Msng1）、Notch 通路基因（Notch1、Lfng）以及体节标志基因（Meox1）的转录水平低于天然胚胎。天然胚胎和 ETiX 胚胎均表达 Gata4 及其他心脏发育的重要调控因子，包括 Gata6、Meis1、Tbx5 和 Hand1（
在观察到外胚层和中胚层的广泛发育与形态发生之后，我们接着考察了确定性内胚层的发育；确定性内胚层将形成肠道及其相关器官。Sox17 是肠道内胚层发育所必需的
来自天然胚胎和 ETiX 胚胎的 scRNA-seq 数据还揭示了与确定性内胚层（Cer1/Sox17/Gata6 阳性）和卵黄囊内胚层肠道祖细胞（Rhox5/Cldn6/Apoa1 阳性）相对应的基因表达特征（
始基生殖细胞（PGCs）在上胚层的近端后部区域出现，其时间大致与 E6.5 天然小鼠胚胎中 Brachyury 的表达同时发生
ETiX 胚胎中卵黄囊的胚外部分附着于一个类似绒毛膜和尿囊的结构。卵黄囊在早期胚胎中支持原始造血，而 Runx1 是造血祖细胞的早期标志物之一
总之，ETiX 胚胎具有在无需提供额外外部信号线索的情况下完成原肠胚形成并显著超越该阶段继续发育的潜力。与迄今为止报道的任何其他干细胞来源胚胎系统不同，ETiX 胚胎能够以与天然胚胎高度相似的方式进行头褶结构的形态发生。我们提出，ETiX 胚胎这种延长的发育依赖于前部信号中心（即 AVE）的形成；该中心保护胚胎前部区域免受促进后部发育的信号影响，并使原条得以正确定位。上述事件共同使原条正前方区域能够正确引导前脑和中脑的形成。
ETiX 胚胎中天然的原肠胚形成运动使其能够进入神经胚形成阶段，形成神经管、启动体节发生，并生成包括解剖学上准确的搏动心脏在内的中胚层结构。目前，我们尚未研究其在建立肠道及其相关器官的内胚层祖细胞之后的进一步发育。值得注意的是，在我们的实验条件下，
在ETiX胚胎中纠正神经管缺陷的能力，凸显了其作为一种强大且易于操作的哺乳动物体系的实用价值，可用于发现使后代易患神经管缺陷的环境因素和遗传因素，解析神经管形成与闭合的分子通路，并筛选潜在治疗方法。由于ETiX胚胎能够再现上胚层及胚外谱系的广泛发育，因此它们为揭示涉及下一代与卵黄囊或胎盘之间相互作用的发育与疾病机制提供了前所未有的机会。
- CAG-GFP/tetO-mCherry小鼠ESC（膜上组成型表达GFP；经Dox处理后瞬时表达mCherry）。亲本CAG-GFP/tetO-mCherry ESC细胞系来源于已有的小鼠品系，该品系具有组成型CAG-GFP表达和Dox诱导的瞬时mCherry表达。该细胞系通过繁育CAG-GFP报告小鼠构建获得。
- CAG-GFP/tetO-mCherry/tetO-Gata4 ESC为本实验室自建。
- Cerl-GFP小鼠ESC（在Cerl启动子调控下表达GFP）来源于已发表的Cerl-GFP小鼠品系。
- Cerl-GFP/tetO-Gata4 ESC为本实验室自建。
- 野生型TS细胞由本实验室利用CD1小鼠建立。
- 野生型CD1 ESC由Jenny Nichols博士惠赠。
- CD1/tetO-Gata4 ESC为本实验室自建。
- Sox2-Venus/Brachyury-mCherry/Oct4-Venus ESC由Jesse Veenvliet博士和Bernhard G. Hermann教授惠赠。
这些细胞系的性别未知，因为我们未对其进行基因分型以确定性别。
所有细胞系均每两周进行一次常规检测，以确保未受支原体污染。
小鼠ESC在明胶包被培养板上于37°C、5% CO2、21% O2条件下培养，培养基为N2B27，其组成为50% Neurobasal-A（Gibco 10888022）、50% DMEM/F-12（Gibco 21331020）、0.5% N2（本实验室自制）、1% B27（Gibco 10889038）、2 mM GlutaMAX（Gibco 35050038）、0.1 mM 2-巯基乙醇（Gibco 31350010）和1%青霉素/链霉素（Gibco 15140122）。
N2B27中补充3 μM CHIR99021（Cambridge Stem Cell Institute）、1 μM PD0325901（Cambridge Stem Cell Institute）和10 ng ml
实验所用小鼠（6周龄CD-1雄鼠购自Charles River，转基因雌鼠由本实验室繁育）饲养于动物房，并遵循国家和国际相关指南。所有实验均依据《1986年动物（科学程序）法》及其2012年修正条例进行监管，并经剑桥大学动物福利与伦理审查机构（AWERB）审查。实验亦获得英国内政部批准。
为准备 AggreWell 板（STEMCELL Technologies 34415），向每个孔中加入 500 μl 抗黏附漂洗液（anti-adherence rinsing solution，STEMCELL Technologies 07010）。随后将培养板以 2,000 × g 离心 5 分钟，并在室温下孵育 20 分钟。之后从孔中吸去漂洗液，向每个孔中加入 1 ml PBS 进行清洗。吸去 PBS 后，向每个孔中加入 500 μl FC 培养基。
为生成 ETiX 胚胎，向 CAG-GFP tetO-Gata4 ESC 中加入多西环素（1 μg/ml）（Sigma-Aldrich D9891-5G）处理 6 小时。将 TSC 经胰蛋白酶消化后加入明胶包被培养板中，于 37°C 下孵育 20 分钟以去除 MEF。随后对 CAG-GFP WT ES 细胞和 CAG-GFP tetO-Gata4 ESC 进行胰蛋白酶消化。
ESC 用 1× PBS 清洗一次，并使用 0.05% trypsin-EDTA（ThermoFisher Scientific）在 37°C 下消化 3 分钟。随后加入 2 ml FC 终止反应。通过轻柔吹打 4–5 次使细胞分散，并以 200 × g 离心 4 分钟。细胞沉淀用 1× PBS 清洗一次，再次离心后重悬于 1–2 ml FC 中。
将含有 19,200 个 TS 细胞、6,000 个 CAG-GFP WT ESC 和 6,000 个 CAG-GFP tetO-Gata4 ESC 的细胞悬液混合，并通过离心收集成沉淀。将细胞沉淀重悬于含有 7.5 nM ROCK 抑制剂（Y27632，STEMCELL Technologies 72304）的 1 ml FC 培养基中。将细胞混合液逐滴加入 AggreWell 后，将培养板以 100 × g 离心 3 分钟。
次日，通过从每个孔中移除 1 ml 培养基并加入 1 ml 不含 ROCK 抑制剂的新鲜 FC 培养基，进行两次换液。第 2 天，进行一次换液，用 1 ml 新鲜 FC 培养基替换 1 ml 原培养基。第 3 天，从每个孔中移除 1 ml 培养基，并在培养箱中平衡 20 分钟后加入 1.5 ml IVC1。IVC1
采用 6 周龄转基因雌鼠与 CD-1 雄鼠进行自然交配。于胚胎发育第 E5.5、E6.5 和 E7.5 天，在 M2 培养基（Sigma M7167）中从蜕膜组织中分离回收小鼠胚胎。按照已报道的方法，将 E6.5 胚胎置于静置条件下在 EUCM 中培养至 E8.5
使用 Gata4/AttB 引物（见表）从 pSAM2-mCherry-Gata4 中通过 PCR 扩增获得 Gata4 cDNA。引物按照 Gateway 克隆手册中的说明进行设计。由于该质粒已含有 attB 位点，因此在引物设计中无需纳入 Gata4 开放阅读框的部分序列。pSAM2-mCherry-Gata4 由 Timothy Kamp 惠赠（Addgene 质粒编号 #72690；
ETiX胚胎和天然小鼠胚胎用4%多聚甲醛于室温固定20分钟，并用PBST（含0.1% Tween 20的PBS）洗涤3次。随后，将其置于透化缓冲液中进行透化处理（PBST中的0.1 M甘氨酸和0.3% Triton X-100）。对于E7.5及之前的胚胎以及培养至第6天及之前的ETiX胚胎，于室温透化30分钟，随后用PBST洗涤3次，每次5分钟。更早期之后的天然胚胎和ETiX胚胎透化35分钟。样品与用封闭液（PBS中含10% FBS和0.1% Tween 20）稀释的一抗于4°C孵育过夜。
经PBST洗涤3次后，再与二抗和DAPI于4°C孵育过夜或于室温孵育2小时，随后再次用PBST洗涤3次后进行成像。
固定后的天然胚胎和ETiX胚胎样品在4°C下于30%蔗糖/PBS（w/v）中进行冷冻保护过夜，或直至样品沉至管底。随后将样品转移至冷冻模具中。小心向冷冻模具中加入OCT包埋剂（Agar Scientific），并置于经干冰冷却的金属块上冷冻。使用冷冻切片机将样品切成厚度为12 μm的切片，收集于赖氨酸包被载玻片上，并于−80°C保存，直至进行免疫荧光实验。免疫荧光按如下方法进行：载玻片先在PBS中洗涤5–10分钟以去除OCT，随后再短暂风干5–10分钟。
样品在室温下用透化缓冲液（PBST中的0.1 M甘氨酸和0.3% Triton X-100）透化10分钟，然后在室温下用封闭液（PBS中含10% FBS和0.1% Tween 20）封闭1小时。透化和封闭后，样品在室温下用PBS洗涤3次，每次5分钟。一抗用封闭液稀释后，于4°C与样品孵育过夜。随后在PBS中洗涤3次，每次5分钟，再于室温下与用封闭液稀释的二抗孵育2小时。最后洗涤3次后，用自制封片剂封片，以指甲油封固，并于避光条件下风干过夜后进行成像。
回收后，将天然胚胎和 ETiX 胚胎切碎，转移至 Falcon 管中，离心，用 PBS 清洗，并在 Tryple Express（Gibco™ 12604013）中孵育 15 分钟；每 5 分钟进行 20 次剧烈吹打，以将其解离为单细胞。如仍有细胞团块残留，则将孵育时间额外延长 5 分钟，并进一步吹打样品。随后使用 40 μm 滤器过滤样品以去除较大团块，以 200 × g 离心 5 分钟，并重悬于 PBST（含 0.02% Tween20 的 PBS）中。
将细胞悬液按 1:1 比例与台盼蓝（Sigma T8154）混合进行计数，以确定活细胞和死细胞的比例，随后用于包封处理（见下文）。
文库按照 inDrops v3 方法制备。
使用 Illumina 的 bcl2fastq 软件将 BCL 文件转换为 Fastq 文件。采用 FastQC 对测序文库进行质量检测。
所有 ETiX 胚胎均于发育第 4 天从 AggreWell 中取出用于分析，并在体视显微镜下进行评估。在所有情况下，我们均选择具有柱状形态、存在两个清晰界定的细胞区室且被外层细胞层包围的 ETiX 胚胎。我们预期 ESC 区室应已上皮化并形成腔隙。TSC 区室在形态上变化更大，因此尽管理想情况下也希望其呈现类似天然胚胎胚外外胚层的上皮样外观，但我们对 TSC 区室的外观选择范围更宽。
在完成这一初步筛选后，会迅速在显微镜下检查含有相应荧光标记的结构，以确认存在已上皮化的 CAG-GFP 阳性 ESC 区室。当 ETiX 采用野生型干细胞系构建时，则仅依据形态进行筛选。随后，将具有正确体制构型、即 ESC 和 TSC 区室被一层类似内脏内胚层的细胞层包围的 ETiX 胚胎转移至平衡后的培养基中继续培养。
然而，在 D5 时进行筛选时，我们加入了额外标准：i）预期 ESC 和 TSC 区室的腔隙应已融合；ii）理想情况下，可观察到 ETiX 胚胎一侧开始发生原肠运动；iii）预期 AVE 已迁移至 ESC-TSC 边界，并位于形成中的原条对侧；iv）AVE 滞留于结构顶端或未位于边界处的 ETiX 均予以排除；v）在使用三重报告细胞时，我们确保其中一侧显示更高的 Sox2-Venus 表达。
图像使用 Leica SP5 和 SP8 共聚焦显微镜（Leica Microsystems）采集，分别配备 40× 油镜物镜和 25× 水镜物镜。使用 405 nm 二极管激光（DAPI）、488 nm 氩激光（Alexa Fluor 488）、543 nm HeNe 激光（Alexa Fluor 568）和 633 nm HeNe 激光（Alexa Fluor 647）激发荧光基团。图像采集的 z 步长为 1.2–5 μm。Fiji
GA 和 CEH 设计并实施了实验及数据分析。JdJ 进行了单细胞 RNA 测序的文库制备和生物信息学分析。FH 监督了单细胞 RNA 测序分析。MZG、GA、CEH 与 DG 共同撰写了手稿。MZG 构思并监督了本研究。
进一步信息以及资源和试剂申请请联系 Magdalena Zernicka-Goetz（
本研究中产生的所有独特/稳定试剂均可在完成材料转让协议后向通讯联系人获取。
本研究中生成的任何自定义代码均可应要求提供。
解剖前第 7 天 ETiX 胚胎的明场图像，显示卵黄囊的存在。比例尺 = 100 μm。
我们感谢 MZG 实验室所有成员在本项目全过程中提出的宝贵意见。
本项目得以开展，离不开以下授予 MZG 的资助：美国国立卫生研究院先锋奖（NIH Pioneer Award，DP1 HD104575-01）、欧洲研究委员会（669198）、Wellcome Trust（207415/Z/17/Z）、Open Philanthropy/Silicon Valley Community Foundation、Weston Havens Foundation 以及滋养层研究中心（Centre for Trophoblast Research）。
FH 获得了欧洲研究委员会（69566）和 Wellcome Trust（）的资助；JdJ 感谢 BBSRC DTP 提供的学生奖学金。CEH 获得了滋养层研究中心和 Leventis Foundation 的资助。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.08.01.502375
🏷️ 干细胞 合成胚胎 胚胎发育 原肠胚形成 器官发生 卵黄囊