胚胎发育的单细胞水平表征是人类发育生物学中的一项重要标杆。对干细胞来源胚胎进行时空分析为该领域带来了概念性和技术性的进展。在本研究中，我们利用干细胞来源的类器官界定了人类胚胎发育的单细胞时空基因表达图谱。我们从扩展潜能干细胞建立了人胚胎类器官（HEMO），并在同一类器官中同时实现了胚内和胚外组织。时间序列单细胞RNA测序结合单细胞分辨率空间分析揭示了人类胚胎发育的特征，包括胚外胎盘、卵黄囊造血、神经嵴、血管和心脏中胚层。
造血组织最终在HEMO中占据主导，并表现出红细胞生成、巨核细胞生成和髓系生成。细胞间通讯网络分析表明，滋养层样组织向神经嵴细胞提供WNT信号以促进其成熟和迁移。单细胞分辨率空间转录组学界定了卵黄囊红系-巨核细胞生成微环境。作为巨核细胞成熟的主要贡献因素，Vitronectin-整合素信号在HEMO及人胎儿样本的卵黄囊微环境中占主导地位。总体而言，本研究推进了在干细胞来源类器官中对人类胚胎发育的时空分析。
基于干细胞的人类胚胎发育建模
结合使用10X Chromium和10X Visium界定胚胎发育与造血的基因表达图谱
WNT信号作为神经嵴成熟和上皮-间质转化（EMT）的调控因子
VTN-ITGA2B作为卵黄囊红系-巨核细胞生成微环境中促进巨核细胞成熟的主要贡献因素
人类胚胎发育始于胚外组织和胚内组织的分隔。胚外组织胎盘和卵黄囊提供造血细胞和营养以支持胚胎发育（
干细胞来源胚胎重建了发育过程和细胞间相互作用。既往研究已利用多能干细胞对人类和小鼠胚胎发育进行建模，或直接使用原代胚胎（
单细胞测序技术的进步以及人类胎儿样本可及性的提高，促成了多种人类胚胎发育细胞图谱的建立（
我们的目标是在干细胞来源类器官中研究人类胚胎发育。鉴于高通量测序技术的进步，我们采用时间序列单细胞RNA测序和空间转录组学来研究胚胎组织发育过程中的细胞间相互作用。
在本研究中，我们利用源自EPSC的人类胚胎类器官（Human EMbryonic Organoid, HEMO）来模拟胚胎组织的发育。时间序列单细胞RNA测序显示，HEMO遵循人类胚胎的发育进程，随后出现胚外组织和三胚层。我们强调，滋养层样组织分泌的WNT信号作为神经嵴细胞成熟和迁移的潜在介导因素发挥作用。结合10X Visium空间转录组学和先进的细胞去卷积方法，我们界定了卵黄囊红系-巨核系造血微环境，并揭示纤连蛋白-整合素是促进巨核细胞成熟的主要贡献因素。
总体而言，HEMO提出了一个人类胚胎发育与造血的模型。
为了模拟人类胚胎发育，我们使用了扩展潜能干细胞（expanded potential stem cells, EPSCs），其具有胚胎和胚外两种分化潜能（
A）人类胚胎类器官（HEMO）的分化方案。人扩展潜能干细胞（EPSCs）在EPSC培养基中维持培养，随后经预分化，并通过悬滴法形成胚样体（EB）。实验设计：在D8、D15和D18采集HEMO样本进行10X Chromium单细胞RNA测序（scRNA-seq）。同时采集D15的HEMO样本进行10X Visium空间转录组测序。右侧面板展示了10X Chromium scRNA-seq的样本制备流程。比例尺 = 500 μm。
B）时间序列HEMO细胞（n=22,296）的scRNA-seq分析，并以UMAP可视化。CM：心脏中胚层；CMP：共同髓系祖细胞；Ery：红细胞；GMP：粒-单核祖细胞；HEC&Ery：成血内皮细胞和红细胞；HPC：造血祖细胞；Immature PSC：未成熟多能干细胞；LPM：侧板中胚层；Mk：巨核细胞；MkP：巨核祖细胞；Mono：单核细胞；NC：神经嵴；NE：神经外胚层；TB-like：滋养层样细胞；VEC：血管内皮细胞；YSE：卵黄囊内胚层。
C）面积图显示分化过程中细胞比例的变化。
D）分别展示D8（n=3,136）、D15（n=8,364）和D18（n=10,796）细胞群体的UMAP图。
E）HEMO发育轨迹的扩散拟时序分析。细胞被嵌入到力导向图中。
F）D15巨核生成过程的RNA velocity分析，依次经历HPC、MkP和Mk阶段。
G）D18髓系生成过程的RNA velocity分析，依次经历CMP、GMP和Mono阶段。
为检验HEMO是否遵循人类胚胎发育过程，采用10X Chromium单细胞RNA测序（scRNA-seq）选取了三个时间点，分别在D8检测胚外谱系、在D15检测三胚层、在D18检测造血过程（
胚外组织中的滋养层样细胞（TB-like cells）和卵黄囊内胚层（YSE）在D8出现。胚胎躯干组织中的心脏中胚层（CM）、神经外胚层（NE）和神经嵴（NC）在D15出现（
总之，HEMO遵循了人类胚胎发育过程。HEMO的时间序列scRNA-seq在单细胞水平揭示了人类胚胎发育与造血的基因表达图谱。
为了考察HEMO的三胚层模式化，我们进一步将非造血细胞簇归类为未成熟PSC、TB样、外胚层（NE、NC）、中胚层（VEC、CM）和内胚层（YSE）。
A）按未成熟PSC、TB样、外胚层（NE、NC）、中胚层（VEC、CM）和内胚层（YSE）群体分组的非造血细胞簇UMAP分析（n = 5,203）。
B）人类早期胚胎胚层示意图，包括滋养层、外胚层、中胚层和内胚层群体。
C）通过UMAP可视化鉴定的细胞群体。KLF4：未成熟PSC；CDH1：TB样；OTX2：外胚层；PDGFRA：中胚层；FOXA2：内胚层。
D）各细胞簇的标志基因表达。
E）面积图显示分化过程中细胞比例变化以及非造血细胞数量的减少。
F）扩散拟时序分析显示HEMO的发育轨迹。细胞被嵌入力导向图中。
G）D15 HEMO中细胞群体的UMAP分析。
H）D15 HEMO细胞群体之间的WNT信号通路相互作用。线条越宽表示相互作用越强。
I）HEMO中D15非造血细胞的NC特化与迁移相关基因表达模式。
J）WNT信号通路及其相关基因示意图。
K）UMAP显示D15 HEMO中WNT信号通路相关基因的表达。
随后，我们利用CellChat研究了胚胎躯干组织发育过程中的细胞—细胞相互作用。
总之，HEMO遵循人类胚胎发育过程，在造血富集之前，首先启动胚外组织和神经嵴的模式化。TB样组织可能通过WNT驱动的EMT程序促进神经嵴细胞的成熟与迁移。
为了考察造血组织中的细胞—细胞相互作用，我们对组织类型多样性达到峰值的D15 HEMO进行了空间转录组学分析。为获得单细胞水平分辨率，我们将10X Visium与H&E成像相结合。通过捕获每个Visium点位中的细胞核，我们对每个点位注释了1–14个细胞。SpatialScope作为一个用于量化每个点位中细胞核数量的框架，基于配对的scRNA-seq数据集推断真实细胞类型（手稿撰写中）。SpatialScope首先进行细胞核分割，以估计每个点位内的大致细胞数。
随后，结合配对的scRNA-seq数据，它基于生成模型将细胞类型分配给每个细胞核。我们获得了近似单细胞分辨率的空间转录组数据。
A）HEMO上10X Visium空间转录组样本制备流程示意图。
B）由SpatialScope推断得到的单细胞水平空间转录组数据的细胞簇UMAP图。
C）空间图显示HEMO及由SpatialScope推断的单细胞。基于细胞核分割和scRNA-seq参考转录组，点位已被解卷积至单细胞水平。
D）堆叠柱状图显示各HEMO中非VEC细胞组成。
E）非VEC细胞类型的Shannon多样性指数。数值越大表示细胞类型越多样。
F）HEMO #1 内 Ery、Mk、MkP 和 YSE 群体的空间分布图。卵黄囊红系-巨核生成生态位以灰色虚线圆圈标示。黄色箭头表示 YSE、Ery 和 Mk 在同一位置的空间共定位。
G）RCTD 预测的 HEMO #1 细胞类型去卷积结果。比例尺表示每个空间点中特定细胞类型所占的比例。
H）采用 CellPhoneDB 进行的空间细胞-细胞相互作用分析。平均值高于 0 的配体-受体对表示该配体-受体对被激活。平均值低于 0 的配体-受体对表示该配体-受体对受到抑制。其中，VTN-ITGA2B 在 YSE 与 Mk 之间表现出最高的富集得分。
I）HEMO #1 空间切片中 VTN 和 ITGA2B 的基因表达模式。
J）HEMO #1 中插补空间数据上 VTN 及相关下游靶基因的表达。
K）D15 scRNA-seq 数据集中 VTN 及相关下游靶基因的表达。
L）基于 I）中激活基因靶标的富集 KEGG 通路柱状图。
M）体内卵黄囊造血数据集中细胞簇的 UMAP 分析（
N）热图显示 HEMO 样本与体内卵黄囊样本之间的相关性。
O）UMAP 显示卵黄囊数据集中 VTN 和 ITGA2B 的基因表达。
P）点图显示卵黄囊数据集中 VTN 及相关下游靶基因的表达。
随后，我们考察了每个 HEMO 中细胞类型的多样性（
我们进一步分析了卵黄囊-造血 HEMO #1 中的细胞-细胞相互作用。YSE 主要位于 HEMO 的边缘，而红系细胞和巨核细胞谱系则出现在 YSE 附近（
最后，我们将 HEMO 与人胎儿组织的 scRNA-seq 数据集进行了比较，以检验其生理相关性（
干细胞来源的胚胎推进了对人类胚胎发育的理解。这为扰动和工程化调控对人类发育至关重要的基因以及疾病建模提供了平台。我们利用扩展潜能干细胞（EPSCs）在同一类器官中同时生成胚外和胚胎组织，而无需对胚外组织进行单独诱导和组装。这使我们能够在一个易于操作的系统中探索人类胚胎发育。通过采用商业试剂盒中的限定培养基，我们提高了不同实验室之间技术的可重复性。
每个类器官中生成多种组织是干细胞来源胚胎的一个标志性特征。当前 scRNA-seq 的局限在于，无法区分每个类器官究竟是由单一细胞类型占主导且不同类器官相互混合，还是每个类器官本身真正具有多谱系特征。在本研究中，我们结合空间转录组学，结果揭示了后者：HEMO 在每个类器官中均产生了多谱系细胞，从而支持其作为干细胞来源胚胎模型的属性。结合时间序列 scRNA-seq 与空间转录组学，我们界定了人类胚胎发育与造血过程的基因表达图谱。
HEMO 遵循人类胚胎发育进程，并获得了内胚层、中胚层、外胚层及滋养层样组织。我们通过配体-受体对，利用 scRNA-seq 和空间转录组学两种正交方法重建了细胞-细胞相互作用。我们观察到来自滋养层的 WNT 信号支持神经嵴细胞的成熟，这一发现凸显了合成胚胎生物学的前景。尽管其在真实胚胎中的生理相关性仍有待未来研究进一步阐明，但通过扰动来增强某些组织成熟的可能性颇具吸引力。
事实上，与人类体内 CS12 脊髓数据集相比，HEMO 中的神经嵴细胞甚至表现出更高的成熟度和功能性，这可由成熟标志物及 EMT 程序所指示。
HEMO 的一个潜在应用是工程化造血细胞和免疫细胞。胚外组织卵黄囊通过玻连蛋白-整合素轴对巨核细胞生成的贡献，为从干细胞产生血小板以用于细胞治疗带来了希望。单核细胞和巨噬细胞的生成还可进一步通过工程化加以利用，以靶向癌症和感染性疾病。对卵黄囊造血微环境的空间性理解及其相关因子的利用，将促进从干细胞生成免疫细胞。
总之，HEMO 展示了其在探索人类胚胎发育与造血过程中功能调控机制方面的潜力。通过遗传学扰动人类干细胞来源类器官的发育过程，是 HEMO 在发育生物学、血液学和免疫学研究中的主要应用之一。
hEPSCs 在 EPSC 培养基中维持和培养，每隔一天更换一次培养基。在形成 EB 之前，细胞首先在 KSR 培养基（DMEM/F12+10% KSR）中预分化 3 天。
去除 KSR 培养基，并用 PBS 清洗细胞。于 37 °C 下使用 500 mL 0.05% Trypsin 消化细胞 3 分钟，但不超过 7 分钟。去除 Trypsin，加入 2 mL KSR 培养基并收集细胞。轻柔操作细胞，避免剧烈吹打。以 300 g 离心 3 分钟。小心去除上清。加入 1 mL KSR 培养基和 1 μL Y27632 重悬细胞。在 10 cm 培养皿盖上，每个 25 μL 悬滴加入 4k 个细胞。每个皿盖制备 30–40 个液滴，并在培养皿中加入 PBS 以保持湿润。
轻轻将皿盖倒置并稍作调整以盖住培养皿。标记后于 37 °C 培养 3 天。
用 PBS 清洗后收集所有 EB。以 100 g 离心 1 分钟。小心去除上清。加入 1 mL 培养基 A（STEMdiff Hematopoietic Kit，货号 05310），并转移至非黏附性 24 孔板。将该日期标记为第 0 天。使用 1 mL STEMdiff 培养基 A 培养 3 天。第 2 天半量换液。随后几天使用 1 mL STEMdiff 培养基 B 继续培养。
自悬滴形成 EB 起，于 D8、D15 和 D18 收获类器官。类器官先用 PBS 清洗，随后用剪刀机械剪碎 20–30 次。组织在 37 °C 下用 500 μL Accumax 消化 10–15 分钟，并用 500 μL 含 2% FBS 的 PBS 终止消化。细胞经 40 μm 细胞滤网收集。细胞悬液以 500 × g 离心 5 分钟，并重悬于 FACS 分选缓冲液（1 × PBS 含 2% FBS）中以进行后续染色。使用血细胞计数板计数后，将细胞浓度调整至约 3k 个细胞/μL。
细胞在 FACS 分选缓冲液中以 1:100 比例加入 DAPI（BD Biosciences，货号 564907），于 4 °C 染色 5 分钟。细胞在 HKUMed 的 CPOS 使用 BD Influx 流式细胞分选设备进行分选。通过设门排除死亡细胞和双ts，并将细胞收集于预冷的单细胞悬液培养基中（1× PBS 含 0.04% BSA），用于后续 scRNA-seq 文库构建。使用血细胞计数板计数后，将细胞浓度调整至约 500–1000 个细胞/μL。
单细胞包封、文库制备及测序由香港大学李嘉诚医学院泛组学科学中心（CPOS）基因组学核心平台完成。单细胞包封及 cDNA 文库采用 Chromium Next GEM Single Cell 3’ Reagent Kit v3.1 和 Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit 制备。包封约 8–16k 个直径为 30 μm 或更小、活性良好的活单细胞，随后进行逆转录和文库制备，以获得 cDNA 文库池。
文库采用 Illumina Novaseq 6000 进行双端 151 bp 测序。每个样本的平均测序通量为 165.5 Gb。
新鲜HEMO于分化第15天收集。用PBS清洗HEMO两次后，将HEMO转移至一次性塑料冷冻包埋模具（Sakura，货号25608-922）中央。加入O.C.T.（Sakura，货号4583）以完全浸没HEMO。将冷冻包埋模具置于干冰盒上直至O.C.T.冻结（至少10 min），随后立即将包埋模具置于-80C保存。
我们使用了Visium Spatial Gene Expression Starter Kit（10x Genomics，货号PN-1000200）。
其组成包括Visium Spatial Tissue Optimization Slide & Reagent Kits（10x Genomics，货号PN-1000193）、Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kits（10x Genomics，货号PN-1000184）以及Visium Accessory Kit（10x Genomics，货号PN-100194）。
冷冻切片厚度为10 μm。通过用冷冻切片刷沿对角线方向轻触周围O.C.T.，将冷冻切片轻柔展平。我们收集了至少25张10-mm-thick冷冻切片。提取RNA后，使用NanoDrop2000（Thermo Scientific，货号ND2000CLAPTOP）进行分析。RIN值通过RNA 6000 Nano获得。合格的RIN值应高于7.0。
使用Tissue Optimization试剂盒优化组织透化时间。将组织冷冻切片贴附、固定、染色，并进行不同时长的透化处理。以荧光核苷酸作为透化指示剂。在荧光显微镜下，以透化样本具有最高亮度和最低扩散程度为标准确定透化时间。最佳透化条件既能保证mRNA释放，又能将mRNA扩散降至最低。在本研究中，组织透化时间范围为6至12分钟。
分化第15天的HEMO样本包埋于O.C.T.中，并通过干冰盒快速冷冻。将10-μm厚的冷冻切片切取后贴附于GEX载玻片上。将载玻片置于Veriti™ 96-Well Fast Thermal Cycler（Applied Biosystems，货号4375305）上，在37C孵育1分钟。孵育后，将载玻片转移至-20C预冷甲醇中固定，随后进行H&E染色。
样本依次在异丙醇（货号I9516-25ML）中孵育1分钟、在苏木精（货号MHS16-500ML）中孵育7分钟、快速清洗15次后在返蓝液（货号CS70230-2）中孵育2分钟，并在伊红混合液（货号HT110216-500ML）中孵育1分钟。将载玻片置于热循环仪上，于37C孵育5分钟。明场图像由NanoZoomer（Hamamatsu，货号C13239-01）以20×分辨率获取。
对于cDNA合成，将染色后的载玻片置于Visium Slide Cassette（Visium试剂盒提供）中。将通透化酶（Permeabilization Enzyme，Visium试剂盒提供）加入载玻片卡匣的孔中。将载玻片卡匣于37C孵育6分钟。随后用0.1 × SSC（Millipore Sigma，货号：S66391L）缓冲液清洗各孔后，加入RT Master Mix（Visium试剂盒提供），并在53C进行45分钟的逆转录反应。
移除RT Master Mix后，向孔中加入0.08 M KOH（Millipore Sigma，货号：P4494-50ML）溶液，并将载玻片于室温孵育5分钟。经Buffer EB（QIAGEN，货号：19086）清洗后，向每个孔中加入Second Strand Mix（Visium试剂盒提供），并将载玻片于65C孵育15分钟。随后再次用Buffer EB清洗载玻片，并向孔中加入0.08 M KOH，于室温处理10分钟。
收集各孔中的样品，并转移至含有Tris溶液（Thermo Fisher Scientific，货号：AM9850G）的8联管中。
cDNA扩增循环数通过qPCR（Takara Bio，货号：RR820A）确定。Cq值定义为峰值荧光值的25%。使用Amp Mix（Visium试剂盒提供）和cDNA Primers（Visium试剂盒提供），按照常规PCR方案，以确定的循环数对cDNA进行扩增。
文库构建采用文库构建试剂盒（10 x Genomics，货号：PN-1000190），并按照制造商说明书进行。对cDNA样品依次进行片段化、末端修复与A尾添加、SPRI（固相可逆固定，Solid Phase Reversible Immobilization）筛选、接头连接以及索引PCR。所得文库两端带有P5和P7序列。
Visium文库由两端带有P5/P7的标准Illumina构建体组成。TruSeq Read 1用于测序空间条形码和UMI。TruSeq Read 2用于测序cDNA插入片段。测序深度范围为28.4 Gb至36.3 Gb。
来自10X Genomics的测序数据采用CellRanger软件（版本6.0.0）并结合GRCh38人类参考基因组进行处理。细胞-基因计数矩阵被导入R中的Seurat软件包（版本4.1.0）（
scRNA-seq数据的数据整合、聚类和注释。在完成所有质量控制及双细胞去除后，采用MNN（
细胞互作通过CellChat（版本1.4.0）（
首先在Scanpy（版本1.9.1）中，将单细胞簇之间的连通性进行量化，并生成为基于分区图抽象的图（PAGA图）（
剪接型和未剪接型RNA由Velocyto（版本0.17.17）进行计数，并使用loompy函数与Scanpy adata进行合并（
单个 10x Visium 载玻片的测序数据和成像 tiff 文件采用 SpaceRanger 软件（版本 1.3.1）并基于 GRCh38 人类参考基因组进行处理。计数矩阵被导入 Python 中的 Scanpy 软件包（版本 4.1.0）。基于 RNA 计数和线粒体基因百分比对 spot 进行筛选。完成 spot 筛选后，鉴定高变基因（HVGs），并将其用于主成分分析（PCA）以进行降维和聚类。Scanpy 的 adata 对象分别用于后续分析。
采用了两个软件包对空间转录组学 spot 进行去卷积。首先实施了 SpatialScope 方法（手稿准备中）。该方法是一个用于量化每个 spot 中细胞核数量，并基于配对的 scRNA-seq 数据推断真实细胞类型的框架。SpatialScope 首先进行细胞核分割，以估计每个 spot 内的近似细胞数目。随后结合配对的 scRNA-seq 数据，基于生成模型为每个基于细胞核定义的细胞分配细胞类型。还使用了 RCTD 软件包（版本 2.0.0）来验证细胞比例（
采用了两个不同的软件包进行空间细胞-细胞相互作用分析。在获得单细胞分辨率的空间数据后，首先使用 Squidpy 工具箱中的 CellPhoneDB 预测细胞间的配体-受体相互作用（
采用 GSEApy 软件包进行了 KEGG 通路分析（
本研究报道的 scRNA-seq 和空间转录组学数据已存入 NCBI，登录号为 PRJNA855311。
用于分析 scRNA-seq 和空间转录组学的脚本已存放于 GitHub：
Y.C.、Y.X. 和 R.S. 构思了本研究。Y.C. 在 Y.H. 和 R.S. 的指导下开展了信息学分析。Y.X. 在 P.T. 和 R.S. 的指导下生成了类器官。J.X.、S.Z.、W.Z.、X.W.、Z.L.、M.G.、G.W. 和 Z.C. 参与了信息学分析。C.Y. 和 A.R.W. 监督了空间转录组学分析。M.E. 对本研究进行了重要审阅。Y.C.、Y.X. 和 R.S. 撰写了手稿。
A）UMAP 显示了三个样本的细胞数量。
B）基于 DoubletFinder 软件包检测所有样本中的双细胞和单细胞。
C）使用 MNN 软件包进行批次校正后的样本，这些样本构成了所有后续分析的基础。
D）小提琴图展示了三个样本中每个细胞的 RNA 总计数、基因总数以及线粒体基因表达百分比。
E）各细胞群体的标志基因表达。
F）散点图展示了 D15 巨核生成过程中关键基因 ITGA2B 的表达及剪接/未剪接水平。
G）散点图展示了 D18 髓系生成过程中关键基因 TGFBR2 的表达及剪接/未剪接水平。
A）D8（n=2,236）、D15（n=2,845）和 D18（n=122）非造血细胞群体的单独 UMAP 图。
B）环形图展示了 WNT4 和 WNT6 亚型的信号通路网络。
A）散点图展示了由 RCTD 预测的 HEMO 组织上的细胞类型解卷积结果。比例尺表示每个点位中该特定细胞类型所占的比例。
A）散点图展示了由 RCTD 预测的 HEMO #1 上的细胞类型解卷积结果。比例尺表示每个点位中该特定细胞类型所占的比例。
B）由 SpatialDM 筛选的 VTN 信号传导的空间配体-受体亚型散点图。
基于 scRNA-seq 参考数据，由 SpatialScope 插补得到的各 HEMO 的细胞数量。标签对应于
我们感谢香港大学李嘉诚医学院 CPOS 在 scRNA-seq 和 FACS 方面提供的技术支持。我们感谢 Cheryl Tam 负责细胞分选操作，并感谢 Helen Lockey 进行英文编辑。我们感谢 Danny Chan、Martin Cheung、Lequan Yu、Joshua Ho、Yuanhua Huang 课题组成员的讨论，以及转化干细胞生物学中心成员提供的讨论和行政支持。
本研究得到 Platform for Technology Fund、RGC ECS 27109921、生物医学学院 Seed Fund 以及 InnoHK Centre for Translational Stem Cell Biology 的资助。
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📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.02.505700
🏷️ 类器官 单细胞转录组 空间转录组 胚胎发育 造血发生 WNT信号