胚胎类器官正作为研究早期哺乳动物发育的强大模型而不断涌现。例如，来源于干细胞的“原肠胚样体”可形成包含全部三个胚层的延长结构。
早期人类发育的分子与细胞生物学具有基础性的重要意义。然而，由于伦理、技术和实践上的困难，研究的机会
研究早期人类发育的另一种方法涉及
我们考察了采用已发表方案生成的小鼠与人类原肠胚样体之间的差异，这使我们提出如下假设：与小鼠原肠胚样体以及相比，先前报道的人类原肠胚样体中的神经中胚层祖细胞（NMPs）更倾向于体节而非神经命运。
我们着手诱导具有较已发表方案更先进形态学特征的人类原肠胚样体。
我们试图追踪在人类原肠胚样体形成这一时间进程中关键细胞群体的出现（
对48至96小时人类原肠胚样体与CS7期人类胚胎谱系进行整合投影的信息量较低，可能是因为这些原肠胚样体已进展超出了这一阶段。
接下来，我们试图探索人类与小鼠原肠胚样体之间的差异。在胚胎中，后部神经管来源于称为神经中胚层祖细胞（NMPs）的双潜能干细胞。
为促进NMPs向神经谱系分化，我们试图提供额外的信号线索，这些线索在人类原肠胚样体系统中推测供给不足。视黄酸（RA）即为这样一种信号分子，能够诱导NMPs产生神经细胞命运，两者中均是如此。
我们推测，持续暴露于RA可能会扰乱其他细胞类型的分化，
这些RUES2-GLR中胚层特异性标志物的空间分布
为鉴定存在的细胞类型，我们将单细胞RNA测序（sc-RNA-seq）应用于人类RA-原肠胚样体。对5,347个和18,324个单细胞表达谱进行聚类与注释，分别在96小时和120小时鉴定出9种和12种细胞类型（
我们惊讶地观察到其中许多额外的细胞类型，
为更深入研究神经外胚层潜在的空间模式化，我们对神经管、神经嵴和神经祖细胞进行了单独重分析，随后考察了所得嵌入空间中标志基因的表达模式（
在人类RA-原肠胚样体中，神经发生的任何方面是否仍在进行？神经祖细胞来源于神经管中由放射状胶质细胞构成的干细胞库。我们分析了HES基因的表达模式，它们是放射状胶质细胞的标志物。
我们还试图通过对旁轴中胚层衍生物进行重分析，对体节开展更为详细的分析（
总体而言，这些分析和免疫染色实验证实，通过引入视黄酸的不连续处理方案，我们能够在人类 gastruloid 中诱导形成神经管和分节的类体节结构。尽管由于缺乏相当于脊索、可分泌 SHH 的结构，背腹轴尚未完全建立，但人类 RA-gastruloid 中包含的若干细胞亚群，比此前在人或小鼠 gastruloid 模型中所实现的细胞类型更为成熟，这提示沿背腹轴（神经嵴）和内外侧轴（中间中胚层）均存在功能性的信号梯度。
特别是在 120 小时的 gastruloid 中，我们还观察到其向更高分化细胞类型进一步进展的趋势（
人类 gastruloid 的最初报道基于形态学特征和 Tomo-seq 进行了评估
然而，这些以及其他分期方法在一定程度上都
作为第一步，我们对人类 gastruloid 和 RA-gastruloid（96–120 小时）的 pooled 样本的 pseudobulk RNA-seq 表达谱，以及两个可获得的人类胚胎 CS7 阶段数据集，进行了主成分分析（PCA）
沿 PC2 方向，人类 gastruloid 能够按照时间正确排序（
随后，我们进一步寻求实现更精细的分期，并将人类 gastruloid 的成熟过程与
尽管存在物种差异，这些经分期的小鼠胚胎沿人类定义的 PC2 也表现出良好的有序排列，这与该主成分捕捉到了哺乳动物发育进程某种普遍特征的观点一致（
鉴于 gastruloid 仅模拟了……的某些方面
总体而言，这些结果表明，人类 RA-gastruloid 可成熟至比先前报道的哺乳动物 gastruloid 模型更高级的阶段，大致接近于小鼠 E9.5–E10.5 的对应水平。然而，这种更大的发育推进可能伴随着与……的不同步
接下来，我们试图评估人类 RA-gastruloid 作为一种可筛选体系的潜力，即在其分化过程中通过化学扰动经典发育信号通路。已知 WNT 信号传导对体节形成具有关键作用
BMP 信号传导在早期发育过程中对谱系分离与维持发挥多种重要作用。为扰动人类 RA-gastruloid 中的 BMP 信号传导，我们修改了实验方案，在 48 小时后向体系中加入 LDN193189（以下称 LDN；一种 BMP 抑制剂）或 BMP4（
为考察经 LDN 处理的 RA-gastruloid 的发育进程，我们将其映射到
然而，尽管神经细胞显著扩增，LDN 处理的 gastruloid 中神经嵴细胞也明显减少（
随后，我们进一步探究人类 RA-gastruloid 作为遗传扰动可筛选模型的潜力。为此，我们选择了转录因子 PAX3 和 TBX6，因为相应突变体在小鼠模型中表现出早期致死性
在小鼠中，Tbx6 是体节谱系分化中公认的主调控因子，并通过抑制 a 的表达来抑制神经元谱系。
总体而言，我们得出结论：RA-胃胚样体可作为一种多功能且稳健的模型，用于研究在人类着床后发育过程中，细胞类型如何在化学与遗传扰动作用下出现的细胞与分子机制。
合成哺乳动物胚胎学领域正处于一个显著发展的轨道上。对于人和小鼠而言，“干细胞胚胎”模型使得早期发育能够接受详细的观察性与扰动性研究，而这在其他情况下根本无法实现。
目前仍不清楚，为什么间断性的 RA 处理方案会在人类胃胚样体中导致神经管和分节体节的形成，而在小鼠胃胚样体中，仅 Matrigel 就足以实现这一过程。
干细胞胚胎模型的大量涌现正在揭示一些新的挑战。例如，难以将这些模型在时间上校准至对应的发育阶段。
日益复杂的干细胞胚胎模型也可能引发伦理方面的担忧，而这些担忧或可通过计算分期加以缓解。例如，在脑类器官的研究背景下，人们已对神经活动提出了相关担忧。
在人类 RA-胃胚样体中，类胚胎形态结构形成的效率远高于相关小鼠系统中的报道（人类 RA-胃胚样体中为 89%［同时具有神经管和分节体节］，而小鼠 TLS 中为 50%）。
多能干细胞系 hESCs（RUES2-GLR）由 Ali Brivanlou 博士（洛克菲勒大学）馈赠。人 ES 细胞在 Geltrex（Thermo，A1413201）包被的培养板上，使用 StemFlex 培养基（Thermo，A3349401）维持培养，并按照制造商建议，常规使用 StemPro Accutase（Thermo，A1110501）传代至新的 Geltrex 包被孔中。
在传代后的最初 24 小时内，hESCs 在含 10 μM Y-27632（Sellek，S1049）的 StemFlex 培养基中培养，以防止细胞凋亡。
RNP 复合物按照制造商提供的流程制备。简而言之，等摩尔量的 crRNA 和 tracrRNA（IDT，1072532，列于
对于整体免疫染色，胃胚样体在 4 °C 下于 4% 多聚甲醛中固定过夜，随后用 PBST（0.2% Tween20）清洗，在封闭液［PBS，含 0.1% BSA 和 0.3% Triton X-100］中于 4 °C 浸泡过夜，随后在 4 °C 下与用封闭液稀释的一抗孵育过夜。样品随后用清洗液［PBS，含 0.3% Triton X-100］清洗，在 4 °C 下与二抗和 DAPI 孵育过夜，然后清洗并使用 Fluoro-KEEPER 抗淬灭封片剂（Nacalai USA）封片。
对于鬼笔环肽染色，将 Alexa Fluor™ 647 Phalloidin（A22287；Thermo）以 1:400 的稀释比例加入二抗中。所有样品均使用 LSM710（Zeiss）或 LEICA SP8X（Leica）共聚焦显微镜进行分析，并设置未加入一抗的阴性对照样品。本研究中使用的抗体列于
使用微量移液器从96个孔中收集胃胚样体（n = 48–96），转移至PBS（-）中以洗去培养基，并在37°C下用0.05% Trypsin-EDTA孵育8 min。加入1/10体积的FBS终止反应后，通过反复吹打将胃胚样体解离为单细胞。按照制造商说明，将解离后的单细胞悬液加载至Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit（Chromium，PN-1000120），并在10X Chromium controller上运行。
使用Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1（Chromium，PN-1000121）和Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns（Chromium，PN-1000215）构建单细胞RNA-seq文库。文库浓度通过Qubit（Invitrogen）测定，文库通过Tapestation（Agilent）进行可视化。
所有文库均在NextSeq 2000（Illumina）上进行测序（Read 1：28个循环，Read 2：85个循环，Index 1：10个循环，Index 2：10个循环）。
使用cellranger v6.0.0将碱基识别结果转换为fastq格式。
随后，将cellranger生成的过滤后feature-barcode矩阵导入R中，并使用Seurat v4.1.1转换为Seurat对象。
采用Seurat中实现的Harmony对时间序列sc-RNA-seq数据集进行整合。简而言之，将各时间点的数据集合并。对合并后的数据集进行log标准化，并筛选前2,000个高变基因用于后续整合。随后，对合并后的数据集进行缩放，并回归掉与细胞周期阶段及线粒体污染相关的异质性。采用PCA进行降维，以生成合并数据集中细胞的低维嵌入表示。随后将该低维嵌入输入Harmony，以校正不同实验中采集样本之间的批次效应。
为了比较胃胚样体细胞类型与Mouse Organogenesis Cell Atlas（MOCA）中的胚胎细胞类型，以及近期通过sci-RNA-seq3从E8.5获得的数据，
来自CS12–16期人胚胎的10x Genomics sc-RNA-seq数据
在可能的情况下，所有胚胎数据集均按胚胎进行伪批量化。具体而言，对于每个基因，将与特定胚胎样本相关联的所有UMI计数（若为混合样本，则为特定胚胎样本）相加。人和小鼠胃胚样体则按样本进行伪批量化（因为这些样本来源于多个胚胎）。具体而言，对于每个基因，将与特定胃胚样体样本相关联的所有UMI计数相加。
由于我们主要关注人类早期胚胎发育，因此采用来自人胚胎发育数据集的高变基因。
采用人胚胎CS12–13期、人胃胚样体（0–96 hrs）和人RA-胃胚样体（96–120 hrs）的伪批量表达谱，基于这455个基因构建PCA空间。具体而言，使用Seurat V4.1对伪批量矩阵进行标准化和缩放。
每个胚胎细胞类型中每个基因的表达值，是通过对E8.5至E10.5各时间点所有胚胎中该类型全部细胞的对数转换后标准化UMI计数求和计算得到的。为尽量减小批次效应，仅选取采用sci-RNA-seq制备的小鼠胚胎。
为将gastruloids中的细胞类型与小鼠胚胎（E8.5–E10.5）中的选定细胞类型进行比较，在两个数据集中选取同源基因，并采用非负最小二乘回归，根据数据集B中所有细胞类型（Mb）的基因表达来预测数据集A中目标细胞类型（Ta）的基因表达，即 Ta = β0a + β1aMb；该分析基于目标细胞类型中表达量最高的200个基因与特异性最高的200个基因的并集。
随后交换数据集A与B进行预测；即根据数据集A中所有细胞类型（Ma）的基因表达来预测数据集B中目标细胞类型（Tb）的基因表达，即 Tb = β0b + β1bMa。最后，对于数据集A中的每种细胞类型a与数据集B中的每种细胞类型b，将两个相关系数按 β = 2(βab + 0.001)(βba + 0.001) 合并，以获得一个统计量，其高值反映双向且特异性的预测能力。随后，对E8.5–E10.5所有选定细胞类型的β评分进行标准化。
通过识别标准化β评分大于5且呈1对1对应关系的胚胎细胞类型，或对标准化评分最高的两种细胞类型之间的发育时间取平均值，来确定gastruloids中每种细胞类型所对应的阶段。
我们的研究经过华盛顿大学胚胎干细胞研究监督委员会（Embryonic Stem Cell Research Oversight, ESCRO）审查并获得批准。
N.H.和J.S.设计了研究。W.Y.、C.K.和N.H.进行了实验。W.Y.和N.H.进行了计算分析。C.K.、C.Q.、S.S.协助进行了数据分析。B.K.M.、R.K.G.、S.G.R.、C.L.、R.M.D.和S.S.协助解释结果。E.N.协助进行了gastruloids成像。J.S.、W.Y.和N.H.撰写了论文，所有作者均提供了意见。
作者声明不存在竞争性经济利益。
在诱导后48小时加入10% Matrigel。
图示为基于sc-RNA-seq谱的UMAP及无监督聚类结果，并同时展示了用于将这些簇注释为原条样细胞、初生中胚层和新生中胚层连续谱系，以及脊索样细胞和确定性内胚层的标志基因表达。DE，确定性内胚层；PS，原条。
图示为基于sc-RNA-seq谱的UMAP及无监督聚类结果，并同时展示了用于将这些簇注释为神经中胚层祖细胞、体节前中胚层、分化前沿和体节连续谱系的标志基因表达；此外还包括晚期中胚层、心脏中胚层，以及脊索样细胞和肠道/内胚层样细胞。NMP，神经中胚层祖细胞；PSM，体节前中胚层。
展示了结合无监督聚类的 sc-RNA-seq 谱的 UMAP，以及用于将这些簇注释为神经中胚层祖细胞、体节前中胚层、分化前沿和体节连续谱系的标志基因表达；此外，还包括高级中胚层和心脏中胚层，以及脊索样细胞和肠道/内胚层样细胞。NMP，神经中胚层祖细胞；PSM，体节前中胚层。
展示了结合无监督聚类的 sc-RNA-seq 谱的 UMAP，以及用于将这些簇注释为神经中胚层祖细胞、体节前中胚层、分化前沿和体节连续谱系的标志基因表达；此外，还包括高级中胚层和心脏中胚层，以及脊索样细胞和肠道/内胚层样细胞。NMP，神经中胚层祖细胞；PSM，体节前中胚层。
sc-RNA-seq 谱的共嵌入，按人类 CS7 胚胎的注释进行标记
96 小时时的人类 gastruloid 与小鼠胚胎（E8.5–10.5）之间的对应细胞类型
在所示共嵌入 UMAP 上，NTC 和遗传扰动的人类 RA-gastruloid 中的标志基因表达
我们感谢 Shendure 实验室的成员以及 Allen 细胞谱系追踪发现中心的成员所提供的宝贵反馈与讨论；感谢 A. Boulgakov 在细胞培养实验中的帮助；感谢 A.M. Arias、N. Moris、A. Alemany 和 SC van den Brink 的有益讨论；感谢 Ali H. Brivanlou 博士提供 RUES2-GLR ESCs；并感谢干细胞与再生医学研究所（ISCRM）的 TOM & SUE ELLISON 干细胞核心平台以及华盛顿大学的 KECK 显微中心。
本研究得到 Paul G. Allen Frontiers Group 的资助（Allen 细胞谱系追踪发现中心，资助 JS）以及美国国家人类基因组研究所的资助（UM1HG011586，资助 JS）。JS 为霍华德·休斯医学研究所研究员。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.02.10.579769
🏷️ 原肠胚样体 早期人类发育 神经管形成 体节分化 类器官模型 计算分期