Cell Research | 劉文強/高紹榮/魏珂/王譯萱團隊實現小鼠器官發生初期胚胎發育高效模擬
點評丨季維智（中國科學院院士）、李勁松（中國科學院院士）
在哺乳動物胚胎早期胚胎發育過程中，桑葚胚經歷兩次關鍵的譜系命運決定，產生外胚層（Epiblast，Epi）、原始內胚層（Primitive Endoderm，PrE）和滋養外胚層（Trophectoderm，TE）這三種最初始細胞譜系。胚胎植入子宮後通過原腸運動產生三胚層結構，進而啟動神經和體節發育，形成心臟等器官原基。這一系列事件對於胚胎著床、器官形成以及胎兒發育具有決定性意義。胚胎幹細胞（ESCs）、胚外內胚層幹細胞（XEN）和滋養層幹細胞（TSCs）的建立為譜系分化和早期胚胎發育研究提供了極大便利。在此基礎上發展的幹細胞類胚胎技術，利用多種幹細胞的自組裝能力，在體外重現了早期胚胎發育與器官發生的複雜生物學事件，為胚胎發育和疾病機制探究提供了新的範式。然而，目前小鼠原腸後類胚胎的構建需要同時使用胚外和胚內來源的多種幹細胞系或依賴轉基因方法，其培養體系複雜且效率低下，這嚴重限制了幹細胞類胚胎技術的廣泛應用【1,2】。因此，突破胚外與胚內早期譜系分化的界限，建立能在體外長期穩定維持的新型雙向潛能幹細胞，並高效地構建原腸後類胚胎模型，將極大地推動該領域的發展。
2025年8月29日，同濟大學高紹榮院士團隊與魏珂教授團隊在Cell Research在線發表題為Modeling Post-Gastrula Development via Bidirectional Pluripotent Stem Cells的研究論文。該研究通過高內涵篩選，成功建立了一種可在體外長期培養的具有胚外-胚內雙向分化能力的新型幹細胞（Bidirectional Pluripotent Stem Cells, BPSCs）。該類細胞同時表達OCT4和CDX2，並且能在體外不添加誘導培養基的情況下，高效自發分化為三類早期胚胎譜系（Epi、TE和PrE）。BPSCs展現出強大的類胚胎形成能力，能夠高效精確的重現小鼠胚胎心臟跳動、神經管閉合、體節形成及原始生殖細胞遷移等一系列關鍵發育事件。這項工作為再現著床後胚胎發育提供了新的細胞平台，也為研究早期人類發育與再生醫學奠定了基礎。
文章中在動態旋轉培養階段使用了Adawarbler®品牌的，基於“滾瓶法”培養原理的小鼠全胚胎旋轉培養儀，實現了體外良好可持續的發育，接近E12。品牌、製造商、型號分別為：Adawarbler®、Eastmo biotech、WEC001-GT4，可參考以下網頁詳情Adawarbler®小鼠全胚胎動態旋轉培養系統
上圖為基於“滾瓶法”培養原理的小鼠全胚胎旋轉培養儀核心結構：金屬分氣單軸迴轉器，型號為，Adawarbler® DishKP3，20孔位；基於近50年來一直沿用的“BTC”標準設計製造，能實現均勻的分氣、分壓以及可自由插拔胚胎培養瓶。
研究團隊首先利用帶有Oct4-GFP和CDX2-mCherry雙重熒光報告基因的擴展多能幹細胞（EPSCs）進行小分子篩選，在1859種小分子中發現AS1842856（FOXO1抑制劑）和LY2090314（GSK3抑制劑）這兩種小分子能夠共同誘導超過70%的細胞呈現OCT4和CDX2雙陽性表達狀態。此類細胞在AL培養條件下可以長期穩定培養，並且EPSCs也可從桑葚胚時期直接建立（圖1）。通過單細胞轉錄組分析發現BPSCs更靠近處於第一次命運決定期的8至16-細胞期胚胎。此外，四倍體補償實驗證明BPSCs具有獨立支援完整胚胎發育至成年的潛能。
圖1 BPSCs的建立（詳見文獻）
在體外自由分化實驗中，研究團隊進一步證明BPSCs可以在不添加額外誘導因子的條件下，於48小時內高效自發分化出CDX2陽性（33.6%）、OCT4陽性（40.9%）及GATA6陽性（8.6%）的三類細胞，三者分別對應E4.5階段囊胚中的三大譜系。這種無需誘導即可分化為三譜系的能力驗證了BPSCs具備的高度可塑性（圖2）。
圖2 BPSCs在無誘導因子條件下自發分化（詳見文獻）
更為關鍵的是，研究團隊利用這一培養體系，在僅使用化學誘導的條件下，從單一細胞起始實現了對E8.5-E8.75器官形成階段胚胎發育的精確模擬（影片1和影片2）。在數日的體外培養中，BPSCs類胚胎逐漸完成了卵黃囊血島產生、頭神經褶發育、神經管形成與閉合、心臟有規律的搏動、體節形成、原始生殖細胞的產生和遷移等多個重要發育事件。免疫熒光與單細胞轉錄組分析顯示，所構建的類胚胎結構在形態結構與細胞組成上與自然胚胎（E8.5-E8.75）高度一致，具備複雜且精細的組織結構。
專家點評Cell Research | 劉文強/高紹榮/魏珂/王譯萱團隊實現小鼠器官發生初期胚胎發育高效模擬
BPSCs中胚外譜系相關基因CDX2、TFAP2C等啟動子區域相比其它幹細胞呈現更加開放狀態，H3K27ac等啟用性表觀標誌明顯增強，這為其分化為胚胎外譜系提供了表觀基礎。在機制上，研究證明Wnt通路的超啟用可通過轉錄因子LEF1上調CDX2的表達。同時在胚胎中敲低LEF1可導致囊胚形成受到抑制，揭示LEF1在體內同樣具有調控胚外譜系細胞命運決定的重要作用。
值得一提的是，該研究還驗證了AL培養系統在人類幹細胞中的適用性。在人類naïve多能幹細胞（nESCs）中加入相同小分子組合（AS與LY）處理數日後，也可誘導出OCT4與CDX2雙陽性狀態。單細胞RNA測序顯示這些人源細胞同樣啟用了一系列滋養層相關基因表達。這一發現提示，BPSCs培養體系在跨物種應用及人類胚胎發育研究中均具備重要的拓展價值，為人類疾病模型建立、藥物篩選及輔助生殖技術優化提供了可行的新途徑。
該工作經歷一年的投稿與改進，於今年6月底發佈在預印本網站BioRxiv上，最終在Cell Research發表。相比之前植入後類胚胎體外培養模型步驟繁瑣且效率低下的問題，BPSCs為類胚胎構建提供了更高效、穩定與簡便的解決方案，也為早期器官發生機制的探索提供了重要的體外模型。本研究與本月José Silva實驗室（專家點評Cell | José Sliva/李歡歡/景乃禾團隊利用小分子誘導新型類全能細胞EFC，實現高精度小鼠類胚胎構建）【3】、Jacob H. Hanna實驗室【4】的研究類似，均用單一細胞起始的化學誘導方法實現了小鼠E8.5-E8.75的胚胎模擬。
同濟大學劉奎升助理研究員、博士研究生燕子回、柏丹丹助理研究員、博士研究生薑睿、畢焱副教授、博士研究生馬祥鈞為該論文的共同第一作者，同濟大學劉文強教授、高紹榮院士、魏珂教授、王譯萱教授為該論文的共同通訊作者。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41422-025-01172-x
專家點評：季維智（中國科學院院士）
建立具有高效胚外和胚內分化能力的高潛能幹細胞是早期譜系分化與胚胎發育研究亟待解決的重要問題，本文通過高內涵篩選，從1859種小分子中成功鑑定出LY2090314（GSK3i）與AS1842856（FOXO1i）兩種小分子可同時促進多能性細胞表達兩種譜系的標誌性基因OCT4和CDX2僅聯用這兩種小分子（AL體系）可使OCT4⁺/CDX2⁺雙向多能幹細胞（BPSCs）長期穩定培養。單細胞轉錄組揭示BPSCs可能代表着16-細胞（桑椹胚）時期的一種發育狀態。BPSCs在體外2天內即可自發分化為滋養外胚層、外胚層和原始內胚層，並在體內四倍體補償實驗中發育成完整個體，併產生可育的後代。進一步，作者利用BPSCs與PrE誘導體系組合，在體外利用單一細胞系重建了相當於小鼠E8.5階段的類胚胎模型，高還原度重現神經管閉合、心跳、體節與原始生殖細胞形成等關鍵發育事件；AL培養條件也適用於人naïve ESC，可誘導其獲得OCT4⁺/CDX2⁺狀態。
本項工作與最近José Silva實驗室、Jacob H. Hanna實驗室的工作相近，創新性的在無轉基因條件下，用純化學方法僅使用一種多能幹細胞實現了E8.5-E8.75的胚胎模擬，其構建效率與還原度均超過多種細胞組合的方法。更加有意思的是本項工作首次鎖定並長期維持OCT4⁺/CDX2⁺雙陽性群體，並發現這一雙向多潛能狀態的誘導是可逆的。機制層面作者也進行了探究，發現Wnt-LEF1軸可能是打破早期譜系壁壘的核心轉錄因子。本項工作的構建方法易於操作，所應用的試劑更簡單，對不同基因型來源的細胞適應性更強。本項工作對人類細胞相似狀態的探索也十分有意義，有望在此基礎上建立human的morula-like細胞並實現人類類胚胎構建效率的巨大提升。該成果為理解第一次細胞命運決定與早期器官發生機制提供了新的體外範式，並在藥物設計開發、基因功能探究、胎盤發育探究及早期妊娠疾病研究等方面具備重要應用潛力。
雖然如此，本研究中TE譜系的發育仍然是十分有限的，體外培養並不能產生完整的胎盤（這是體內發育所必須得），更多的是依賴卵黃囊進行營養交換。因此建立一種可以完全替代胎盤的TE-like細胞是未來研究的重要方向。
專家點評：李勁松 （中國科學院院士）
尋求更高發育潛能的幹細胞與體外重現胚胎長期發育是目前發育生物學最為重要的研究方之二。本研究在這兩個方面均實現了突破性進展。在理論層面，研究首次捕獲了介於多能性與全能性之間的關鍵過渡態細胞——雙向多能幹細胞（BPSCs）。通過小分子組合（AL培養基）誘導OCT4/CDX2雙陽性表達（>70%），顛覆了"OCT4與CDX2互斥"的傳統認知。BPSCs在體內和體外均實現了高效的胚內和胚外的發育，顯示出比多能性狀態更高的可塑性。同時作者揭示了Wnt-LEF1軸是突破譜系分化屏障的關鍵（LEF1敲除導致胚胎停滯於桑椹胚階段），為哺乳動物早期命運決定提供全新框架。
本研究與之前José Silva實驗室、Jacob H. Hanna實驗室的研究相似，使用無基因操作的化學重編程方案開發了單細胞系胚胎模型構建策略，利用相同基因背景的細胞更高效的模擬了E8.5-E8.75的胚胎發育。類胚胎重現了腦形態發生、心臟搏動、體節形成及原始生殖細胞遷移等事件。
本研究的優越性在於提示了AL方案跨物種普適性，人源nESCs中誘導雙陽性細胞達48.7%，且具備與第6-7天胚胎相似的EPI/TE雙譜系特徵。其次本研究還建立了同一細胞起源，分別向TE-like與PrE-like細胞誘導的策略，兩種譜系的誘導方法均高效快速，為研究人員單獨研究TE或PrE的分化機制提供了良好的平台。這些技術突破不僅大幅簡化了實驗操作，還提高了實驗的可重複性和效率，使得類胚胎構建從複雜的多細胞系組合轉向更可控的單細胞系體系。本研究可以長期維持OCT4⁺/CDX2⁺狀態也是其優勢之一，提示早期胚胎發育早期的祖細胞可以被取得並穩定培養。
本項研究的類胚胎依然不能實現翻轉併發育至E9.5之後，這是之後的重要研究方向。另一方面本研究雖然可以利用BPSCs構建類囊胚，但是其體內發育仍然受限，不能產生完整的體內胚胎。
參考文獻：
[1]TARAZI S, AGUILERA-CASTREJON A, JOUBRAN C, et al. Post-gastrulation synthetic embryos generated ex utero from mouse naive ESCs [J]. Cell, 2022, 185(18): 3290-306 e25.
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本文來源於微信公眾號：BioArt 2025年08月30日 09:41