由幹細胞生成的類胚胎結構能夠達到不同程度的發育里程碑，但尚無研究表明其能夠經歷原腸胚形成、神經胚形成和器官發生的完整過程。
在自然發育過程中，合子發育形成三種初始譜系：上胚層（epiblast），其將形成機體本身；胚外內臟內胚層（VE），其參與卵黃囊形成；以及胚外外胚層（ExE），其參與胎盤形成。來源於這些譜系的幹細胞提供了一種可能性，即不再依賴單個全能性合子，而是從多個組分完全再生哺乳動物個體。
來源於上胚層的胚胎幹細胞（ESCs）在聚集後表現出形成類胚胎結構的顯著能力。例如，包埋於Matrigel中的ESC聚集體（“gastruloids”）可形成具有體幹樣結構的組織，其中包含體節、神經管和腸道。
起源於胚外組織的信號對於多能性上胚層的圖式化以及前後軸的建立至關重要。基於自然發育中對胚外細胞這一需求的認識，我們通過將ESCs與來源於ExE前體的滋養層幹細胞（TSCs）以及來源於VE前體的胚外內胚層幹細胞（XEN）聚集，構建了合成胚胎。
上述所有策略的一個侷限在於，未能準確再現自然胚胎的發育過程；而自然胚胎會經歷上皮—間充質轉化、原腸胚形成、器官發生以及前腦結構的發育。在此，我們確定了能夠使ETiX胚胎重現原腸胚形成及自然著床後發育至胚胎第8–8.5天條件。此類ETiX胚胎具有前腦和中腦區域、有序的神經管、搏動的心臟以及腸管。神經管兩側伴有發育中的體節，並且我們觀察到尾部區域原始生殖細胞的形成。上胚層的這些結構位於胚外卵黃囊內部，而該卵黃囊啟動了血島發育。
據我們所知，ETiX胚胎是迄今為止在所有幹細胞來源體系中發育潛能最大且生理相關性最高的體系。
為確定支援ETiX胚胎形成前腦結構的條件，我們按照先前所示的方法接種ESCs、TSCs和iXEN細胞。
ETiX胚胎能夠忠實重現天然小鼠胚胎的發育。
我們還通過檢測基因表達變化對發育過程進行了監測。具體而言，我們分別分離了第5天、第6天和第8天的單個ETiX胚胎，以及E6.5、E7.5和E8.5階段的天然胚胎，將其解離為單細胞並進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）。UMAP分析顯示，在天然胚胎與ETiX胚胎中，細胞對各發育譜系的貢獻具有相似性。
天然胚胎和ETiX胚胎在上胚層不同胚層（外胚層、中胚層、內胚層）之間，以及胚胎譜系與胚外譜系（上胚層、胚外外胚層、胚外中胚層和胚外內胚層）之間的細胞分佈總體上表現出高度保守性（
在自然發育過程中，上胚層前側保持其上皮特徵，自E8.0起上調神經外胚層標誌物Sox1的表達，並開始形成神經系統。神經外胚層譜系產生前腦、中腦、後腦和脊髓。
為考察神經發育，我們通過免疫熒光分析了公認的神經外胚層標誌物的表達。在ETiX第7天胚胎中，Sox1和Sox2在神經上皮細胞群中沿整個前後軸表達，其模式與天然E8.0胚胎相似（
轉錄因子Otx2參與中腦和前腦的模式形成
接下來，我們利用scRNA-seq數據考察了以下關鍵標誌物的表達：1）神經外胚層，其產生神經系統；2）表面外胚層，其產生大多數上皮組織；3）脊索，其對神經外胚層和神經管的模式形成至關重要；4）上胚層，其是所有這些組織的前體。在ETiX胚胎和天然脊索中，我們觀察到FoxA2、Chordin和Shh具有可比的表達（
與神經系統相關的缺陷是人類中第二常見的發育異常
在自然胚胎發生過程中，神經中胚層祖細胞（NMPs）對神經管和軸旁中胚層的衍生組織均有貢獻
軸旁中胚層進一步形成體節，體節是沿發育中胚胎前後軸形成的成對細胞塊，是骨骼肌、血管和皮膚節段性形成所必需的
另一組註定形成心臟的細胞也在原腸胚形成期間自原條中出現。在天然小鼠胚胎中，這一顯著的發育事件發生於約E8.0，此時隨着心臟中胚層分化為心肌細胞，心跳得以建立。我們在ETiX第8天胚胎中觀察到在腦區下方形成了搏動結構（補充影片1）。肌球蛋白重鏈II（Myh2）和轉錄因子Gata4對心臟發育是必需的，我們發現該搏動區域表達Myh2和Gata4（
來自中胚層及其衍生物的 scRNA-seq 數據證實並擴展了我們從免疫熒光實驗中獲得的發現。導向體節形成的基因表達特徵在 ETiX 胚胎中是明顯存在的，儘管前體節身份基因（Tbx6、Hes7 和 Msng1）、Notch 通路基因（Notch1、Lfng）以及體節標誌基因（Meox1）的轉錄水平低於天然胚胎。天然胚胎和 ETiX 胚胎均表達 Gata4 及其他心臟發育的重要調控因子，包括 Gata6、Meis1、Tbx5 和 Hand1（
在觀察到外胚層和中胚層的廣泛發育與形態發生之後，我們接着考察了確定性內胚層的發育；確定性內胚層將形成腸道及其相關器官。Sox17 是腸道內胚層發育所必需的
來自天然胚胎和 ETiX 胚胎的 scRNA-seq 數據還揭示了與確定性內胚層（Cer1/Sox17/Gata6 陽性）和卵黃囊內胚層腸道祖細胞（Rhox5/Cldn6/Apoa1 陽性）相對應的基因表達特徵（
始基生殖細胞（PGCs）在上胚層的近端後部區域出現，其時間大致與 E6.5 天然小鼠胚胎中 Brachyury 的表達同時發生
ETiX 胚胎中卵黃囊的胚外部分附着於一個類似絨毛膜和尿囊的結構。卵黃囊在早期胚胎中支援原始造血，而 Runx1 是造血祖細胞的早期標誌物之一
總之，ETiX 胚胎具有在無需提供額外外部信號線索的情況下完成原腸胚形成並顯著超越該階段繼續發育的潛力。與迄今為止報道的任何其他幹細胞來源胚胎系統不同，ETiX 胚胎能夠以與天然胚胎高度相似的方式進行頭褶結構的形態發生。我們提出，ETiX 胚胎這種延長的發育依賴於前部信號中心（即 AVE）的形成；該中心保護胚胎前部區域免受促進後部發育的信號影響，並使原條得以正確定位。上述事件共同使原條正前方區域能夠正確引導前腦和中腦的形成。
ETiX 胚胎中天然的原腸胚形成運動使其能夠進入神經胚形成階段，形成神經管、啟動體節發生，並生成包括解剖學上準確的搏動心臟在內的中胚層結構。目前，我們尚未研究其在建立腸道及其相關器官的內胚層祖細胞之後的進一步發育。值得注意的是，在我們的實驗條件下，
在ETiX胚胎中糾正神經管缺陷的能力，凸顯了其作為一種強大且易於操作的哺乳動物體系的實用價值，可用於發現使後代易患神經管缺陷的環境因素和遺傳因素，解析神經管形成與閉合的分子通路，並篩選潛在治療方法。由於ETiX胚胎能夠再現上胚層及胚外譜系的廣泛發育，因此它們為揭示涉及下一代與卵黃囊或胎盤之間相互作用的發育與疾病機制提供了前所未有的機會。
- CAG-GFP/tetO-mCherry小鼠ESC（膜上組成型表達GFP；經Dox處理後瞬時表達mCherry）。親本CAG-GFP/tetO-mCherry ESC細胞系來源於已有的小鼠品系，該品系具有組成型CAG-GFP表達和Dox誘導的瞬時mCherry表達。該細胞系通過繁育CAG-GFP報告小鼠構建獲得。
- CAG-GFP/tetO-mCherry/tetO-Gata4 ESC為本實驗室自建。
- Cerl-GFP小鼠ESC（在Cerl啟動子調控下表達GFP）來源於已發表的Cerl-GFP小鼠品系。
- Cerl-GFP/tetO-Gata4 ESC為本實驗室自建。
- 野生型TS細胞由本實驗室利用CD1小鼠建立。
- 野生型CD1 ESC由Jenny Nichols博士惠贈。
- CD1/tetO-Gata4 ESC為本實驗室自建。
- Sox2-Venus/Brachyury-mCherry/Oct4-Venus ESC由Jesse Veenvliet博士和Bernhard G. Hermann教授惠贈。
這些細胞系的性別未知，因為我們未對其進行基因分型以確定性別。
所有細胞系均每兩週進行一次常規檢測，以確保未受支原體污染。
小鼠ESC在明膠包被培養板上於37°C、5% CO2、21% O2條件下培養，培養基為N2B27，其組成為50% Neurobasal-A（Gibco 10888022）、50% DMEM/F-12（Gibco 21331020）、0.5% N2（本實驗室自制）、1% B27（Gibco 10889038）、2 mM GlutaMAX（Gibco 35050038）、0.1 mM 2-巰基乙醇（Gibco 31350010）和1%青黴素/鏈黴素（Gibco 15140122）。
N2B27中補充3 μM CHIR99021（Cambridge Stem Cell Institute）、1 μM PD0325901（Cambridge Stem Cell Institute）和10 ng ml
實驗所用小鼠（6周齡CD-1雄鼠購自Charles River，轉基因雌鼠由本實驗室繁育）飼養於動物房，並遵循國家和國際相關指南。所有實驗均依據《1986年動物（科學程序）法》及其2012年修正條例進行監管，並經劍橋大學動物福利與倫理審查機構（AWERB）審查。實驗亦獲得英國內政部批准。
為準備 AggreWell 板（STEMCELL Technologies 34415），向每個孔中加入 500 μl 抗黏附漂洗液（anti-adherence rinsing solution，STEMCELL Technologies 07010）。隨後將培養板以 2,000 × g 離心 5 分鐘，並在室溫下孵育 20 分鐘。之後從孔中吸去漂洗液，向每個孔中加入 1 ml PBS 進行清洗。吸去 PBS 後，向每個孔中加入 500 μl FC 培養基。
為生成 ETiX 胚胎，向 CAG-GFP tetO-Gata4 ESC 中加入多西環素（1 μg/ml）（Sigma-Aldrich D9891-5G）處理 6 小時。將 TSC 經胰蛋白酶消化後加入明膠包被培養板中，於 37°C 下孵育 20 分鐘以去除 MEF。隨後對 CAG-GFP WT ES 細胞和 CAG-GFP tetO-Gata4 ESC 進行胰蛋白酶消化。
ESC 用 1× PBS 清洗一次，並使用 0.05% trypsin-EDTA（ThermoFisher Scientific）在 37°C 下消化 3 分鐘。隨後加入 2 ml FC 終止反應。通過輕柔吹打 4–5 次使細胞分散，並以 200 × g 離心 4 分鐘。細胞沉澱用 1× PBS 清洗一次，再次離心後重懸於 1–2 ml FC 中。
將含有 19,200 個 TS 細胞、6,000 個 CAG-GFP WT ESC 和 6,000 個 CAG-GFP tetO-Gata4 ESC 的細胞懸液混合，並通過離心收集成沉澱。將細胞沉澱重懸於含有 7.5 nM ROCK 抑制劑（Y27632，STEMCELL Technologies 72304）的 1 ml FC 培養基中。將細胞混合液逐滴加入 AggreWell 後，將培養板以 100 × g 離心 3 分鐘。
次日，通過從每個孔中移除 1 ml 培養基並加入 1 ml 不含 ROCK 抑制劑的新鮮 FC 培養基，進行兩次換液。第 2 天，進行一次換液，用 1 ml 新鮮 FC 培養基替換 1 ml 原培養基。第 3 天，從每個孔中移除 1 ml 培養基，並在培養箱中平衡 20 分鐘後加入 1.5 ml IVC1。IVC1
採用 6 周齡轉基因雌鼠與 CD-1 雄鼠進行自然交配。於胚胎發育第 E5.5、E6.5 和 E7.5 天，在 M2 培養基（Sigma M7167）中從蜕膜組織中分離回收小鼠胚胎。按照已報道的方法，將 E6.5 胚胎置於靜置條件下在 EUCM 中培養至 E8.5
使用 Gata4/AttB 引物（見表）從 pSAM2-mCherry-Gata4 中通過 PCR 擴增獲得 Gata4 cDNA。引物按照 Gateway 克隆手冊中的說明進行設計。由於該質粒已含有 attB 位點，因此在引物設計中無需納入 Gata4 開放閱讀框的部分序列。pSAM2-mCherry-Gata4 由 Timothy Kamp 惠贈（Addgene 質粒編號 #72690；
ETiX胚胎和天然小鼠胚胎用4%多聚甲醛於室溫固定20分鐘，並用PBST（含0.1% Tween 20的PBS）洗滌3次。隨後，將其置於透化緩衝液中進行透化處理（PBST中的0.1 M甘氨酸和0.3% Triton X-100）。對於E7.5及之前的胚胎以及培養至第6天及之前的ETiX胚胎，於室溫透化30分鐘，隨後用PBST洗滌3次，每次5分鐘。更早期之後的天然胚胎和ETiX胚胎透化35分鐘。樣品與用封閉液（PBS中含10% FBS和0.1% Tween 20）稀釋的一抗於4°C孵育過夜。
經PBST洗滌3次後，再與二抗和DAPI於4°C孵育過夜或於室溫孵育2小時，隨後再次用PBST洗滌3次後進行成像。
固定後的天然胚胎和ETiX胚胎樣品在4°C下於30%蔗糖/PBS（w/v）中進行冷凍保護過夜，或直至樣品沉至管底。隨後將樣品轉移至冷凍模具中。小心向冷凍模具中加入OCT包埋劑（Agar Scientific），並置於經乾冰冷卻的金屬塊上冷凍。使用冷凍切片機將樣品切成厚度為12 μm的切片，收集於賴氨酸包被載玻片上，並於−80°C保存，直至進行免疫熒光實驗。免疫熒光按如下方法進行：載玻片先在PBS中洗滌5–10分鐘以去除OCT，隨後再短暫風乾5–10分鐘。
樣品在室溫下用透化緩衝液（PBST中的0.1 M甘氨酸和0.3% Triton X-100）透化10分鐘，然後在室溫下用封閉液（PBS中含10% FBS和0.1% Tween 20）封閉1小時。透化和封閉後，樣品在室溫下用PBS洗滌3次，每次5分鐘。一抗用封閉液稀釋後，於4°C與樣品孵育過夜。隨後在PBS中洗滌3次，每次5分鐘，再於室溫下與用封閉液稀釋的二抗孵育2小時。最後洗滌3次後，用自制封片劑封片，以指甲油封固，並於避光條件下風乾過夜後進行成像。
回收後，將天然胚胎和 ETiX 胚胎切碎，轉移至 Falcon 管中，離心，用 PBS 清洗，並在 Tryple Express（Gibco™ 12604013）中孵育 15 分鐘；每 5 分鐘進行 20 次劇烈吹打，以將其解離為單細胞。如仍有細胞團塊殘留，則將孵育時間額外延長 5 分鐘，並進一步吹打樣品。隨後使用 40 μm 濾器過濾樣品以去除較大團塊，以 200 × g 離心 5 分鐘，並重懸於 PBST（含 0.02% Tween20 的 PBS）中。
將細胞懸液按 1:1 比例與台盼藍（Sigma T8154）混合進行計數，以確定活細胞和死細胞的比例，隨後用於包封處理（見下文）。
文庫按照 inDrops v3 方法制備。
使用 Illumina 的 bcl2fastq 軟件將 BCL 文件轉換為 Fastq 文件。採用 FastQC 對測序文庫進行質量檢測。
所有 ETiX 胚胎均於發育第 4 天從 AggreWell 中取出用於分析，並在體視顯微鏡下進行評估。在所有情況下，我們均選擇具有柱狀形態、存在兩個清晰界定的細胞區室且被外層細胞層包圍的 ETiX 胚胎。我們預期 ESC 區室應已上皮化並形成腔隙。TSC 區室在形態上變化更大，因此儘管理想情況下也希望其呈現類似天然胚胎胚外外胚層的上皮樣外觀，但我們對 TSC 區室的外觀選擇範圍更寬。
在完成這一初步篩選後，會迅速在顯微鏡下檢查含有相應熒光標記的結構，以確認存在已上皮化的 CAG-GFP 陽性 ESC 區室。當 ETiX 採用野生型幹細胞系構建時，則僅依據形態進行篩選。隨後，將具有正確體制構型、即 ESC 和 TSC 區室被一層類似內臟內胚層的細胞層包圍的 ETiX 胚胎轉移至平衡後的培養基中繼續培養。
然而，在 D5 時進行篩選時，我們加入了額外標準：i）預期 ESC 和 TSC 區室的腔隙應已融合；ii）理想情況下，可觀察到 ETiX 胚胎一側開始發生原腸運動；iii）預期 AVE 已遷移至 ESC-TSC 邊界，並位於形成中的原條對側；iv）AVE 滯留於結構頂端或未位於邊界處的 ETiX 均予以排除；v）在使用三重報告細胞時，我們確保其中一側顯示更高的 Sox2-Venus 表達。
圖像使用 Leica SP5 和 SP8 共聚焦顯微鏡（Leica Microsystems）採集，分別配備 40× 油鏡物鏡和 25× 水鏡物鏡。使用 405 nm 二極管激光（DAPI）、488 nm 氬激光（Alexa Fluor 488）、543 nm HeNe 激光（Alexa Fluor 568）和 633 nm HeNe 激光（Alexa Fluor 647）激發熒光基團。圖像採集的 z 步長為 1.2–5 μm。Fiji
GA 和 CEH 設計並實施了實驗及數據分析。JdJ 進行了單細胞 RNA 測序的文庫製備和生物資訊學分析。FH 監督了單細胞 RNA 測序分析。MZG、GA、CEH 與 DG 共同撰寫了手稿。MZG 構思並監督了本研究。
進一步資訊以及資源和試劑申請請聯繫 Magdalena Zernicka-Goetz（
本研究中產生的所有獨特/穩定試劑均可在完成材料轉讓協議後向通訊聯繫人取得。
本研究中生成的任何自定義代碼均可應要求提供。
解剖前第 7 天 ETiX 胚胎的明場圖像，顯示卵黃囊的存在。比例尺 = 100 μm。
我們感謝 MZG 實驗室所有成員在本項目全過程中提出的寶貴意見。
本項目得以開展，離不開以下授予 MZG 的資助：美國國立衛生研究院先鋒獎（NIH Pioneer Award，DP1 HD104575-01）、歐洲研究委員會（669198）、Wellcome Trust（207415/Z/17/Z）、Open Philanthropy/Silicon Valley Community Foundation、Weston Havens Foundation 以及滋養層研究中心（Centre for Trophoblast Research）。
FH 獲得了歐洲研究委員會（69566）和 Wellcome Trust（）的資助；JdJ 感謝 BBSRC DTP 提供的學生獎學金。CEH 獲得了滋養層研究中心和 Leventis Foundation 的資助。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.08.01.502375
🏷️ 幹細胞 合成胚胎 胚胎發育 原腸胚形成 器官發生 卵黃囊