基因在空間和時間上的正確表達水平對於正常發育至關重要。基因組學的進展使得推斷發育過程中處於活躍狀態的基因調控程序成為可能。然而，這種方法無法捕捉胚胎發生過程中發生的複雜多細胞相互作用。與果蠅和斑馬魚等模式生物相比，哺乳動物胚胎的生長
胚胎樣體（gastruloids）是具有自組織能力、基於幹細胞構建的合成胚胎，能夠以可重複的方式重現後枕部胚胎發育早期階段的關鍵特徵。胚胎樣體通過聚集300個小鼠胚胎幹細胞（mESCs）48小時生成，隨後給予Wnt通路激動劑Chiron 24小時脈衝處理
轉錄因子（TFs）是DNA結合蛋白，但在細胞核環境中，核小體可構成TF與基因調控元件結合的屏障。因此，這些區域在染色質中的物理可及性可作為一種調控機制
為了捕捉發育中胚胎樣體內的基因調控複雜性，我們採用了時間序列單細胞組合索引ATAC-seq（sciATAC-seq）
為了界定引導胚胎樣體發育的基因調控圖譜，我們檢測了改良版本的sciATAC-seq
胚胎樣體發育的染色質可及性圖譜。A）培養方案進行至72、96和120小時時典型胚胎樣體的明場顯微圖像。120小時的軀幹樣結構（TLS）是在96小時起於5% Matrigel中培養胚胎樣體後獲得的。比例尺：200 µm。B）用於sciATAC-seq的培養流程及樣本採集策略示意圖。C）單細胞可及性數據經UMAP降維後的結果，按採集時間點着色（左）或按Leiden聚類後着色（右）。各簇按推斷的細胞類型標註。
Prog：祖細胞；NMP：神經中胚層祖細胞；SC：脊髓；Endo：內胚層；SMD：體節中胚層；PxMD：旁軸中胚層；PhMD：咽中胚層；Enth：內皮。D）Irx3基因附近的示例基因組區域，上方顯示按簇彙總的偽總體覆蓋度，下方顯示單細胞覆蓋度。箭頭指示了一個在NMP和SC簇中特異性可及的區域。E）馬賽克圖顯示了採集時間點與細胞簇組合中與細胞數成比例的面積。F）Upset圖展示了每個細胞簇特有標記峰的數量及細胞簇之間常見組合的數量。“Other”類別表示所有出現頻率過低、未被納入展示的標記峰總和。
胚胎樣體的可及性反映了多種胚胎組織中的可及性。A）胚胎來源合併單細胞可及性數據經UMAP降維後的結果
我們的時間分辨sciATAC-seq數據集使我們能夠確定胚胎樣體發育所依賴的調控級聯。為此，我們進行了擬時序分析，該分析沿推定的分化軌跡進程對細胞進行排序
在胃樣體發育過程中，CDX2 和 MSGN1 基序呈現瞬時富集。A）UMAP 圖中顯示的擬時序，並用箭頭標示所提出的分化分支。B）UMAP 圖顯示了細胞水平的轉錄因子結合位點基序富集情況，包括 OCT4::SOX2 複合基序、CDX2 和 MSGN1，同時以 logo 形式展示其位置權重矩陣。C）熱圖顯示了沿所提出的分化分支排序的細胞中的基序富集：（I）NMP–脊髓分化分支（左）以及（II–III）體節性–旁軸/咽部中胚層分支（右）。每個單元表示 10 個細胞分箱後的平均值。
基序 Z 分數經過 GC 偏倚校正，用於描述相對於群體平均水平，在檢測到相關基序的位點處可及性增加或降低的程度。
胃樣體發育過程中調控圖譜的變化主要由轉錄因子驅動。為了鑑定與細胞類型特異性調控元件結合的關鍵驅動轉錄因子，我們對差異可及性峰（DA peaks）進行了 DNA 結合基序富集分析。我們發現，在祖細胞簇中，調控元件富集了與多能性相關的 OCT4::SOX2 基序，該基序可被 OCT4 和 SOX2 結合，同時還富集了 Wnt 效應轉錄因子 TCF3 的結合位點。
在 NMP–脊髓分化軌跡上，我們觀察到隨着祖細胞向 NMP 狀態轉變，OCT4::SOX2 和 TCF3 基序的富集程度下降（
這表明這些細胞已經為向 NMP–脊髓分化軌跡分化做好了預置準備。我們發現，當 NMP 進一步分化為脊髓細胞時，CDX2 基序富集水平再次下降（
接下來，我們分析了體節中胚層–旁軸中胚層分化軌跡中的轉錄因子基序。與 NMP–脊髓軌跡類似，我們觀察到在從祖細胞向體節中胚層轉變時，OCT4::SOX2 和 TCF3 基序富集急劇下降，同時獲得了 MSGN1（Mesogenin1）結合基序的富集，
鑑於在 NMP–脊髓分支中觀察到富集 CDX 基序的開放染色質區域呈現瞬時增加，我們希望檢驗 CDX1、2、4 在胃樣體發育過程中脊髓細胞形成中的功能必需性。為此，我們嘗試利用 ΔCDX1,2,4（ΔCDX）HM1 mESCs 生成胃樣體。
CDX和MSGN1缺失對類原腸胚細胞類型組成的影響。A）120小時WT和ΔCDX類原腸胚的明場顯微鏡圖像。比例尺：200 µm。B）WT和ΔCDX類原腸胚軸比的定量分析（n = 3個生物學重複；重複1 = 圓形，WT：10個類原腸胚，ΔCDX：8個類原腸胚；重複2 = 方形，WT：10個類原腸胚，ΔCDX：10個類原腸胚；重複3 = 菱形，WT：10個類原腸胚，ΔCDX：12個類原腸胚）。
C）120小時WT和ΔCDX類原腸胚的共聚焦免疫熒光（IF）圖像，染色標記為FOXC1中胚層標誌物（洋紅色）和SOX2脊髓標誌物（綠色）。DAPI為藍色。比例尺：200 µm。D）120小時WT和ΔCDX類原腸胚中FOXC1和SOX2表達的定量分析（n = 2個生物學重複；重複1 = 圓形，WT：5個類原腸胚，ΔCDX：5個類原腸胚；重複2 = 方形，WT：5個類原腸胚，ΔCDX：5個類原腸胚）。
E）UMAP圖，突出顯示120小時WT類原腸胚中的細胞，相對於時間序列實驗中獲得並以柔和顏色顯示的細胞。F）與E相同，但為ΔCDX類原腸胚。G）120小時WT和ΔMSGN1類原腸胚的明場顯微鏡圖像。比例尺：200 µm。H）WT和ΔMSGN1類原腸胚形態的定量分析（n = 3個生物學重複；重複1：WT：10個類原腸胚，ΔMSGN1：10個類原腸胚；重複2：WT：20個類原腸胚，ΔMSGN1：20個類原腸胚；重複3：WT：20個類原腸胚，ΔMSGN1：20個類原腸胚）。
I）與C類似，但為120小時WT和ΔMSGN1類原腸胚。J）120小時WT和ΔMSGN1類原腸胚中FOXC1和SOX2表達的定量分析（n = 2個生物學重複；重複1 = 圓形，WT：7個類原腸胚，ΔMSGN1：6個類原腸胚；重複2 = 方形，WT：5個類原腸胚，ΔMSGN1：6個類原腸胚）。K）與E和F相同，但為ΔMSGN1類原腸胚。L）120小時WT、ΔCDX和ΔMSGN1類原腸胚中各細胞群體比例的定量分析。M）WT、ΔCDX和ΔMSGN1類原腸胚中所測定分化軌跡的示意總結。
儘管免疫熒光分析有助於測量標誌基因的空間分佈，但它無法確定ΔCDX類原腸胚中調控亞型的組成。因此，我們在120小時對WT類原腸胚和ΔCDX類原腸胚進行了sciATACseq。WT HM1類原腸胚顯示出與我們的E14 WT 120小時類原腸胚相似的細胞類型組成，這表明我們的sciATACseq和類原腸胚實驗方案具有穩健性和可重複性（
由於我們觀察到MSGN1基序在體節中胚層—旁軸中胚層擬時序軌跡中富集，因此我們研究了MSGN1在類原腸胚發育過程中的作用。我們使用ΔMSGN1 mESCs進行了類原腸胚分化
我們的推理是，如果NMP向脊髓細胞的分化獨立於MSGN1，而是依賴於不同細胞類型之間的相互作用，那麼當這種相互作用環境由外源性方式提供時，NMP向脊髓細胞的分化應當能夠發生。Gastruloid是進行這一研究的理想模型系統，因為可以混合不同的mESC細胞系來構建嵌合gastruloid。
與僅由ΔMSGN1 EGFP+細胞形成的gastruloid相比，由WT mCherry+和ΔMSGN1 EGFP+細胞組成的嵌合gastruloid在120 h時發生了延長（
在能夠有效形成旁軸中胚層的WT細胞存在的情況下，ΔMSGN1細胞可以形成脊髓細胞。A）嵌合gastruloid的示意圖，以及僅表達熒光團的WT、僅表達熒光團的ΔMSGN1和嵌合WT + ΔMSGN1 gastruloid在120小時的寬場熒光顯微鏡圖像。比例尺：200 µm。
B）WT、ΔMSGN1和嵌合gastruloid形態的定量分析（n = 2個生物學重複；重複1：WT：10個gastruloid，ΔMSGN1：10個gastruloid，嵌合體：10個gastruloid；重複2：WT：10個gastruloid，ΔMSGN1：11個gastruloid，嵌合體：9個gastruloid）。C）沿前後軸對嵌合gastruloid中熒光團強度的定量分析。
D）120小時WT + ΔMSGN1嵌合gastruloid的共聚焦免疫熒光圖像，染色標記FOXC1（藍色）、SOX2（灰色）、EGFP（綠色）和mCherry（洋紅色）。比例尺：200 µm。E）D中虛線方框所示區域的細節圖，顯示ΔMSGN1細胞對脊髓形成的貢獻。SOX2和FOXC1如圖所示為洋紅色，EGFP為綠色。比例尺：200 µm。F）WT、ΔMSGN1和嵌合gastruloid中FOXC1和SOX2表達的定量分析。
G）嵌合gastruloid中mCherry+（WT）區域和EGFP+（ΔMSGN1）區域內FOXC1和SOX2表達的歸一化定量分析。通過計算強度的加權平均值，對每個gastruloid所有光學切片中的強度進行彙總，其中每個切片中的面積作為權重。每個重複的平均強度以對應WT樣本的平均強度進行歸一化。H）對嵌合gastruloid中測得的分化軌跡的示意性總結。
為了確定WT mCherry+細胞和ΔMSGN1 EGFP+細胞對中胚層和脊髓的貢獻，我們進行了譜系標誌物的免疫熒光分析。與未標記細胞的實驗結果相反，我們在ΔMSGN1 EGFP+ gastruloid中未觀察到多個CDX2+/TBXT+突起（圖S4C、E；圖S5A）。我們認為，這可能是由於為了實現細胞的EGFP標記而對ΔMSGN1 mESC進行了反覆傳代培養所致。
與WT mCherry+ gastruloid相比，ΔMSGN1 EGFP+ gastruloid中FOXC1+中胚層以及SOX2+脊髓均顯著減少，這與我們先前的觀察結果一致（
在此，我們系統性地解析了小鼠類原腸胚發育過程中的染色質調控圖譜，界定了這一合成胚胎模型中出現的主要調控亞型。我們發現，除初始祖細胞池外，大多數亞群與原腸胚形成後胚胎中的對應群體具有高度相似性。這種相似性表明，類原腸胚能夠忠實重現後部胚胎發育中的細胞類型及其相關調控圖譜，與轉錄組學研究的發現相一致。
來源於ΔCDX mESCs的類原腸胚缺乏NMP，但仍含有數量有限的脊髓細胞。在缺乏NMP的情況下仍存在這些脊髓細胞，提示細胞分化並非遵循僵化的軌跡，而是在經典路徑受損時可能採取替代路徑。然而，這一路徑以及ΔCDX類原腸胚中脊髓細胞的來源目前仍不清楚。一種可能性是，它們直接來源於祖細胞池，從而繞過NMP階段。另一種可能性是，由於CDX基因對於NMP狀態的維持是必需的。
基於我們的擬時序分析，我們並未在脊髓/中胚層分叉的起始位置發現NMP，這與先前的建議不同。
通過分析旁軸中胚層軌跡主要驅動因子的突變體，我們證明了MSGN1的內在作用是在類原腸胚中促進旁軸中胚層的形成。
CRN無法在簡單的單一培養體系中進行研究，因為根據定義，它們需要多種細胞類型之間的相互作用。然而，在發育中的胚胎和類原腸胚等多細胞結構中，對GRN的擾動可能產生意想不到的後果，正如我們所見。
在本研究中，我們使用了E14（IB10亞系）和HM1 mESC，兩者均來源於129品系小鼠。
在嵌合類原腸胚實驗中，按所示分別使用EGFP或mCherry對E14、HM1-ΔCDX和HM1-ΔMSGN1進行了遺傳標記。該標記通過PiggyBac載體完成（由Bas van Steensel慷慨饋贈）。
類原腸胚按先前所述的方法進行培養。
編碼Tn5的基因採用非連接酶依賴性克隆法（LIC）克隆至pETNKI-6xhis-SUMO3-LIC載體中，該載體含有N端6xHis-SUMO3標籤。
重組Tn5蛋白在Rosetta2（DE3）細胞中於3升LB培養基中表達，培養基中補加30 µg/ml卡那黴素和40 µg/ml氯黴素。細胞在37°C下培養至OD。
Tn5蛋白基本按照先前所述的方法進行純化。
對於bulk和單細胞ATAC實驗，轉座子通過將10 µL 10X TE緩衝液、45 µL 100 µM pMents寡核苷酸以及45 µL 100 µM相應的i5和i7寡核苷酸混合進行退火（詳見寡核苷酸列表）。隨後，將接頭溶液於95ºC孵育10分鐘，並以0.1ºC/秒降溫至4ºC。為形成轉座複合體，將退火後的接頭以等體積稀釋於H中。
sciATACseq按先前所述的方法進行。
簡而言之，將50,000個mESCs收集於冷PBS中，並使用2×裂解緩衝液（Tris-HCl pH 7.5 1 M、NaCl 5 M、MgCl2 1 M、10% IGEPAL）進行裂解。隨後，將細胞沉澱並與2×TD緩衝液和2 μL轉座子混合液孵育。接着，使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix及P5和P7帶索引引物（見寡核苷酸列表）進行兩輪PCR擴增。使用AMPure XP磁珠純化長度在200至700 bp之間的片段。
採用Bioanalyzer High Sensitivity DNA分析系統（Agilent）進行質量控制。
對單細胞組合索引ATAC-seq產生的fastq文件進行編輯，使fastq註釋中的i5、i7、P5和P7條形碼組合（以下稱為“barcode”）以前綴“BC:Z:”添加，以便將條形碼轉移至比對文件中。編輯後的fastq文件使用bwa程序0.7.17-r118版本，並通過命令“bwa mem -MC”比對至mm10參考基因組。
當某一條形碼對應至少2,000個唯一的核片段，且該條形碼的TSS評分超過4時，該條形碼被認為代表一個細胞。TSS評分通過對UCSC已知基因轉錄起始位點中心化的100個鹼基對區域進行計算獲得。
在二值化計數矩陣中，若某峰在少於2%的細胞中檢測到片段，則將其排除。此外，我們還排除了距離TSS 1.5 kb以內的峰。
細胞聚類採用Leiden算法，在基於批次整合後主成分計算得到的共享最近鄰（SNN）圖上進行。SNN圖使用bluster R/Bioconductor軟件包中的“makeSNNGraph”函數構建。
基序的位置頻率矩陣通過以下方法獲得。
擴散擬時序使用destiny R/Bioconductor軟件包進行計算。
如上所述，在合併胚胎數據和我們的gastruloid數據的片段上進行峰調用。細胞註釋取自以下文獻的補充數據。
使用Axios Observer Z1顯微鏡（Zeiss）測量gastruloid的形態以及熒光標記細胞的空間分佈。對於形態學評分，在盲法條件下對gastruloid的寬場圖像進行評分，並根據其形態將gastruloid分為卵圓形、延長形和多極形。對於ΔCDX gastruloid實驗，使用Fiji測量軸比。
gastruloid的染色按照先前描述的方法進行。
對於圖像定量分析，採用方差分析（ANOVA）。
我們謹向 de Wit 實驗室的成員致謝，感謝他們對本手稿進行審閱並提出批判性意見。我們感謝 Alfonso Martinez Arias 對本手稿初稿提出的富有洞見的意見。我們感謝 James Briscoe 慷慨提供 CDX 和 MSGN1 敲除小鼠胚胎幹細胞（ESC）系。
我們感謝 NKI 的各項平台設施，尤其是流式細胞術平台在 sciATACseq 實驗中的協助、高性能科研計算平台對計算分析的支援、基因組學核心平台提供的測序服務、高通量篩選平台對 gastruloid 培養自動化的支援，以及生物成像平台對顯微分析的支援。de Wit 實驗室的研究工作得到歐洲研究委員會（ERC）整合型資助項目（865459，“FuncDis3D”）以及荷蘭研究委員會（NWO）Vidi 項目“016.16.316”的支援。
L.B.、T.vd.B.、N.A.S. 和 E.d.W. 隸屬於 Oncode，該機構部分由荷蘭癌症協會資助。
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