由於植入後人類胚胎在子宮內發育所涉及的倫理與技術挑戰，我們研究人類早期植入後發育的能力仍然受到極大限制。儘管在人類原腸胚樣體、軸體樣結構以及體外培養的囊胚樣體方面已取得重大進展，但這些精巧的模型並不構成一種整合性的幹細胞來源胚胎模型（SEMs），因為它們未包含早期植入後人類孕體的所有關鍵胚外組織（例如，下胚層、卵黃囊、滋養層、羊膜和胚外中胚層），因此也無法在這些胚外區室的背景下重現植入後上胚層的發育。
近期研究表明，小鼠初始態多能幹細胞（PSCs）能夠產生胚胎性與胚外胚層幹細胞，這些細胞可自組裝形成原腸運動後階段的小鼠SEMs，繞過類囊胚階段，並最終啟動器官發生。
由於難以獲得人類妊娠這些早期階段的相關胚胎樣本，以及存在技術和倫理方面的挑戰，我們對人類早期植入後發育的理解一直受到限制。
在培養條件下捕獲處於不同發育狀態的人類多能幹細胞（PSCs）的能力。
近期研究表明，小鼠PSC具有可被誘導的能力。
在小鼠中，獲得包含關鍵胚胎與胚外區室的SEMs需要最佳培養條件，以及從初始態多能幹細胞（PSC）快速高質量誘導原始內胚層（PrE）和滋養外胚層（TE）；這一點分別通過異位表達Gata4和Cdx2得以成功實現。
因此，我們首先着手建立一個類似的平台，以通過在人類初始態PSC中瞬時表達這些轉基因來獲得胚外譜系（
由於在小鼠中，ACTIVIN A並非細胞向PrE預備化所必需。
我們的下一步是檢驗在RCL誘導方案中是否存在PDGFRa+ PrE和/或ExEM細胞，並區分二者。免疫染色和RT-PCR分析均證實，在RCL條件下內源性表達了PrE標誌基因，包括僅標記PrE亞群的SOX17，以及GATA4、GATA6和NID2基因（
與此同時，我們着手尋找用於獲得滋養外胚層（TE）譜系細胞的最佳條件，使其能夠與其他譜系充分聚集，併發育為植入後階段的人類SEMs。
在小鼠SEM模型中，已建立的胚胎來源TSC細胞系在聚集過程中可以替代iCdx2誘導的PSC，而不影響最終結果。
近期研究提示，GATA3在人類TE誘導過程中可能具有重要作用。
為了更詳細地研究我們的人類SEMs發育過程，並獲得適當的參照，我們主要依賴於“虛擬人類胚胎項目”的數據。該項目基於胚胎Carnegie分期，是迄今最為詳盡且最具相關性的可用資料來源。
在人類和非人靈長類動物（NHP）中，內細胞團分離為兩個譜系：上胚層（Epi），由表達 OCT4 的柱狀細胞構成。
在人類胚胎植入後早期、原腸形成前階段，已存在部分胚外中胚層（ExEM）。
在人類胚胎發育至 11–12 dpf（CS5c）時，胚盤分離為腹側假復層上胚層和背側鱗狀羊膜（Am）。
隨後，我們旨在更詳細地表徵 SEM 中關鍵譜系的發育。由於上胚層來源於初始的 naïve PSCs，我們檢測了其在與其他譜系共聚集並置於 N2B27 基礎培養條件後是否發生 priming。確實，在共聚集後不久，我們觀察到 naïve 標誌基因（DNMT3 和 STELLA）的表達喪失，而這些基因最初在 HENSM 條件下的起始 naïve PSCs 中表達。
在哺乳動物中，前後（AP）軸的早期出現較為普遍，其特徵是部分 Epi 細胞在胚盤預定後側開始啟動 BRACHYURY（T）的表達。
自第 6 天起，Epi 顯示出早期羊膜囊形成的模式化，表現為與推定羊膜相對應的背側鱗狀細胞群，以及腹側柱狀假復層上胚層細胞。
在人類中，卵黃囊在 CS4 與 CS5 之間開始由下胚層形成。位於上胚層下方的下胚層部分（形成特徵性的雙層胚盤）屬於內臟內胚層（VE），並且是上胚層模式化的動態信號中心。它與壁內胚層（PE）相連，共同形成內部腔隙——初級卵黃囊（PYS），該結構在發育過程中會發生重組。
接下來，我們旨在表徵上述位於卵黃囊下方的 OCT4 陰性且 SOX17 陰性的細胞群。
人類和 NHP 胚胎的組織學描述表明，隨着 ExEM 的擴張，PYS 腔發生重塑，隨後 PYS 殘餘部分發生縮頸分離並囊泡化，最終形成次級卵黃囊（SYS）。
滋養層發育的腔隙期大約始於 14 dpf，此時滋養層合體內出現充滿液體的間隙，這些間隙相互融合並將滋養層分隔為小梁結構。
滋養層合體的另一項重要功能是分泌激素，如人絨毛膜促性腺激素 β（HCGB），其維持妊娠的多種生理方面。針對 HCGB 的免疫染色表明，在 SEM 周圍的滋養層細胞中該激素蛋白豐富存在，並在細胞內囊泡中富集。
為了以更為無偏的方式進一步驗證並考察本文所構建的人類SEM中存在的細胞類型環境，我們對選取的第4、6和8天SEM進行了基於Chromium 10X scRNA-seq的單細胞轉錄組分析。我們分析了這些實驗時間點經人工挑選並彙集的高質量SEM中約4,000–8,000個細胞。經過質量控制和嚴格篩選後，共有12,190個單細胞被用於後續分析（
在4個已註釋的Epi簇中（均在表達OCT4（POU5F1）和SOX2的同時表達CD24這一預備態多能性標誌物（
在3個不同的卵黃囊（YS）簇中，這些簇共同表達GATA4、GATA6、PDGFRA和APOA1（簇3、5和9），我們發現，最近在狨猴中鑑定的繼發性卵黃囊（SYS）標誌物
隨後，我們將人類SEM數據集中細胞的轉錄譜與整合的人類胚胎參考圖譜進行了比較分析
研究人類植入後早期發育對於理解正常人類胚胎發生的基礎以及發育性出生缺陷至關重要，因為約三分之一的人類妊娠在著床至妊娠第4周之間失敗
在這裏，我們重新調整並採用了一種與近期在小鼠中描述的方法相當的策略
人類（以及小鼠）SEM的形成繞過了類囊胚階段這一事實，以及
原始型多能幹細胞的培養條件通常採用FGF/MEK信號抑制，而這會在長期傳代後導致印記丟失
檢驗本文所述的人類SEM是否能夠像小鼠SEM那樣進一步發育，直至完成原腸形成並啟動器官發生，可能具有至關重要的實驗意義，並可能為此前無法觸及的人類早期發育階段提供見解
B.O.和E.W.建立了SEM聚合條件及離體子宮外培養方案，設計並完成了大部分濕實驗工作，並參與了稿件撰寫。B.O.建立了人幹細胞培養條件及誘導方案。E.W.和V.B.完成了大部分胚胎免疫染色和共聚焦成像。V.B.進行了光片顯微鏡分析並協助撰寫稿件。B.O.在S.V.協助下構建了細胞系，並優化了最終的SEM方案。A.A.C.進行了部分聚合實驗以及該系統的滾瓶培養適配、免疫染色、顯微成像和用於10X scRNA-seq實驗的樣本製備。M.Y.C.協助進行人幹細胞培養擴增和優化。
C.Z.在F.L.和S.P.指導下，完成了scRNA-seq與既往人類及非人靈長類數據集的比較分析。S.T.參與了譜系誘導條件的優化。R.C.製備了MEF及其他對幹細胞維持至關重要的試劑。S.A.和D.L.進行了免疫染色和RT-PCR。F.R.、C.J.和M.R.協助進行了免疫染色。N.L.協助完成慢病毒製備和流式細胞術實驗。E.A.負責監督流式細胞術和分選實驗。T.S.協助進行了生物資訊學分析。S.V.構建了質粒。A.A.C.、M.K.和H.K.S.進行了RNA文庫製備和測序。
S.A.就光片顯微鏡實驗與分析優化提供了意見。N.N.負責進行並監督生物資訊學分析。J.H.H.提出了本項目的構想，並監督數據分析和稿件撰寫。
J.H.H.已提交與本文所報告發現相關的專利申請，並擔任Renewal Bio Ltd.的首席科學顧問；該公司已獲得本文所述技術的許可。
在人與小鼠中，對GATA3、GATA4和GATA6基因進行了ATAC-seq和RNA-seq分析，檢測對象包括初始態PSC及多種分化細胞類型（如圖所示）。人初始態PSC採用HENSM條件培養。已知增強子以底部灰色條標示。推定增強子以紅色或綠色標示：(1) 綠色表示在初始態幹細胞中已處於開放狀態的潛在增強子；(2) 紅色表示在初始態多能幹細胞中處於關閉狀態、但在至少一種分化細胞狀態中開放的增強子。基因近似區域內的推定增強子通過人工篩選確定。與啟動子或外顯子重疊的開放區域未納入分析。
圖中還展示了所示基因在初始態PSC中的RNA-seq結果。後者表明，Gata6、Gata3和Gata4是胚外譜系分化的主調控因子。
引物名稱、5’至3’端的DNA序列，以及引用的參考文獻（如適用）。
由Seurat軟件包鑑定的人SEM中13個細胞簇各自的頂部標誌基因（average log2(Fold-change)>0.25）。
該影片展示了構成第8天人類SEM的胚胎及胚外組織結構的三維重建。對上胚層（OCT4，青色）、卵黃囊（SOX17，黃色）、滋養層（CK7，品紅色）和細胞核（DAPI，白色）進行了免疫熒光標記。0–8秒，顯示SEM形態及外層滋養層的三維視圖，其中可見體積增大的多核細胞（亦可見於22秒開始的切片）。8–22秒和39–42秒，顯示上胚層（青色）和下胚層（黃色）的三維分割，並以DAPI免疫熒光信號作為背景。
22–38秒，對三維體積進行切片，展示SEM的內部結構，包括具有羊膜的雙層胚盤、與外層滋養層相連的結構、具有腔隙的卵黃囊，以及周圍具有廣泛細胞間隙的結締組織。圖中勾勒出了免疫熒光信號和組織分割結果。圖像採用Zeiss Z7光片顯微鏡取得（見方法部分），並使用Imaris v10.0.0進行處理。
第6天人類SEM的三維重建顯示了第6天SEM的三維形態（0–12秒）以及上胚層中央原羊膜腔的早期形成（12–18秒）。對OCT4（上胚層，青色）、F-肌動蛋白（紅色）和細胞核（DAPI，白色）進行了免疫熒光標記。圖像採用Zeiss LSM 800顯微鏡取得（見方法部分），並使用Imaris v10.0.0進行處理。
第8天人類SEM的三維重建顯示了胚盤（SOX2，青色）和羊膜（TFAP2C，品紅色）。上胚層（青色）和羊膜（粉色）的分割結果以半透明輪廓形式與免疫熒光信號一同顯示。17–21秒，人類SEM上胚層呈盤狀。圖像採用Zeiss Z7光片顯微鏡取得（見方法部分），並使用Imaris v10.0.0進行處理。
第6天人類SEM的三維重建顯示了卵黃囊的發育（由SOX17，黃色標記）。5–18秒，放大顯示髒層和壁層卵黃囊細胞，其細胞形態分別為柱狀和鱗狀，並具有頂端細胞極性（aPKC，綠色）。F-肌動蛋白（紅色），細胞核（DAPI，白色）。圖像採用Zeiss LSM 700顯微鏡取得（見方法部分），並使用Imaris v10.0.0進行處理。
第8天人類SEM的三維重建顯示了位於卵黃囊（黃色）下方並表達VIM（紅色）的胚外中胚層細胞。OCT4（上胚層，青色），細胞核（DAPI，灰色）。圖像採用Zeiss LSM 700顯微鏡取得（見方法部分），並使用Imaris v10.0.0進行處理。
第8天人類SEM的三維重建顯示了合體滋養層的發育，其同時表達SDC1（品紅色）和HCGB（綠色），並具有多個腔隙。F-肌動蛋白（紅色），細胞核（DAPI，灰色）。11–19秒，對三維體積進行切片，顯示多個滋養層腔隙的內部結構。圖像採用Zeiss LSM 700顯微鏡取得（見方法部分），並使用Imaris v10.0.0進行處理。
本文所報告的所有涉及人類PSC的實驗，均在獲得魏茨曼研究所IRB批准（1868-2）後開展，以生成人類
未使用統計學方法預先確定樣本量。樣本在置於不同生長條件時進行了隨機分配。其他實驗未進行隨機化。由於不存在相關的科學理由，研究人員在實驗過程中及結果評估期間未對分配情況實施盲法。
使用了以下已建立的人類ESC系：WIBR3（WT女性）、WIBR2（WT女性）和WIBR1（WT男性）人ES細胞系
人ESC的種子庫在經照射的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）飼養層上培養，並維持於常規人FGF/KSR始發態條件下。
MEF基質上的FGF/KSR條件為：DMEM-F12（Invitrogen 10829），補充20% Knockout Serum Replacement（Invitrogen 10828-028）、1 mM GlutaMAX（Gibco 35050061）、1%非必需氨基酸（BI 01-340-1B）、1%丙酮酸鈉（BI 03-042-1B）、1%青黴素-鏈黴素（BI 03-031-1B）以及8 ng/mL bFGF（Peprotech 100-18B-1MG）。
為將始發態PSC重編程為幼稚態，按照Bayerl等人的方法對人PSC進行維持和擴增
為構建Tet-ON誘導型細胞系，我們採用了PiggyBac質粒，該質粒在多西環素誘導型啟動子控制下表達所選cDNA插入片段及轉座酶載體（Volker Busskamp惠贈，Addgene質粒#104454）。供體載體攜帶M2Rtta以及一個用於插入目標轉錄因子cDNA的位點。
我們利用該載體在WIBR3 WT女性人ESC中構建了4種不同的DOX誘導型細胞系：human iCDX2或human iGATA3（用於促進人PSC向滋養外胚層分化），以及human iGATA4或human iGATA6（用於促進人PSC向原始內胚層/胚外中胚層預備化）。進行了約6–8天的嘌呤黴素篩選。挑取抗性克隆並進行培養，以用於後續表徵。在DOX（2 µg/ml）誘導目標基因後，通過免疫染色驗證插入。已證實轉基因表達僅在相應細胞系中加入DOX後才可特異性檢測到。
這些細胞系的詳細構建、表徵和驗證見（
TSC細胞系分別根據Okae等人和Viukov等人的方法，在幼稚態（HENSM）（nTSC）和始發態條件（pTSC）下建立
人TE細胞來源於人幼稚態PSC；這些細胞先在人HENSM條件下擴增至少3代。在誘導細胞接種前24小時，將其鋪板於包被1% Matrigel（corning 356231）的培養板中，並在HENSM中補加10 µM ROCK抑制劑Y27632（Axon 1683）；次日開始實驗流程。用於人TE誘導的3天方案此前已有描述，並改編自Io等人的方法
如上所述，Pre/ExEM 細胞由在 HENSM 條件下至少傳代擴增 3 代的人類 naïve PSCs 誘導而來。誘導時，於誘導前一天將 HENSM 細胞接種於明膠-MEF 包被板上，並加入 10 µM ROCKi Y27632；次日將培養基更換為 RCL，持續培養 72 h。
本研究最終發表時將附帶一份逐步詳盡的實驗方案。簡而言之，為了從人類 naïve PSCs 生成 SEM，使用 AggreWell 24-well plate 400（STEMCELL Technologies 34415）對以下三種起始細胞混合物進行共聚集：
在含 5% CO 的條件下於 HENSM 培養基中培養的 naïve PSC（nPSC）WT 細胞
對於原始內胚層和胚外中胚層組分（PrE/ExEM），將 naïve WT 細胞接種於經輻照的 MEF（小鼠胚胎成纖維細胞條件）/明膠包被板上，在補充有 10 µM ROCKi（Axon Medchem 1683）的 HENSM 中培養。次日，用 PBS 清洗細胞兩次（不進行收穫），並將 HENSM 更換為 RCL 培養基。在 CO 條件下，RCL 持續培養 72 h，並每 24 h 更換一次培養基。
對於滋養外胚層譜系，將 naïve WT 細胞接種於無飼養層條件（Matrigel）下，並在補充有 10 µM ROCKi 的 HENSM 中培養。次日，用 PBS 清洗細胞兩次（不進行收穫），並將 HENSM 更換為 BAP 培養基培養 24 h，隨後更換為 APJ 再培養 48 h，在 5% CO 條件下進行。
共聚集被定義為該方案的時間點 0。聚集前 12–24 h，所有供體細胞均補充 10 µM ROCKi（Axon Medchem 1683）。在聚集當天（第 0 天），按照製造商說明對 AggreWell 400 24 孔板進行準備。簡而言之，每孔加入 500 µl anti-adherence rinsing solution（STEMCELL Technologies 07010），將孔板以 2,000g 離心 5 min，並在室溫下孵育 30 min。隨後去除清洗液，並用 PBS 清洗孔板。
每孔加入 500 µL 聚集培養基，並於 37°C 放置以平衡培養基。
聚集培養基（補充 BSA 的 N2B@7 培養基）由以下成分組成：500 ml Neurobasal（Invitrogen 21103-049）與 DMEM/F12（Invitrogen 21331）的 1:1 混合液，5 ml 青黴素-鏈黴素（Biological Industries 03-033-1B），5 ml GlutaMAX（Invitrogen 35050061），5 ml NEAA（Biological Industries 01-340-1B），5 ml 丙酮酸鈉（Biological Industries 03-042-1B），10 ml B27 添加劑（Invitrogen 17504-044），5 ml N2 添加劑（Invitrogen 17502048），1 ml 50 mM β-巰基乙醇（Gibco 31350-010），以及 2.25 ml 35% BSA 溶液（Merck 9048-46-8）。
三種細胞群均使用 TrypLE（Thermo Fisher 12604054）在 37°C 下收集（HENSM 和 RCL 誘導的細胞群處理 3 分鐘，BAP(J) 誘導的細胞處理 5 分鐘）。隨後用真空抽吸去除 TrypLE，並將細胞在室溫下孵育 2 分鐘，之後使用 PBS 收集細胞。細胞以 1300 rpm 離心 3–5 分鐘，並重懸於聚集培養基中。接下來，將 RCL 誘導的細胞鋪板於明膠包被的組織培養板上，在 MEF 培養基中於 37°C 下進行 30 分鐘的 MEF 去除。
MEF 培養基組成為：500 ml DMEM（Gibco 41965-039）、20% FBS（Sigma, F7524-500ml）、5 ml 青黴素-鏈黴素（Biological Industries 03-033-1B）、5 ml GlutaMAX（Invitrogen 35050061）、5 ml NEAA（Biological Industries 01-340-1B）以及 5 ml 丙酮酸鈉（Biological Industries 03-042-1B）。
MEF 去除結束後，收集上清並通過 70 µM 細胞濾網，隨後將三種細胞類型分別離心、重懸，並在 N2B27 培養基中通過 70 µM 細胞濾網。對三種細胞組分進行計數，並按如下比例在 Aggrewell 400 板中混合：1:1:3（HENSM:RCL:BAPJ）或（Epi:PrE/ExEM:TE）= 每個 24 孔加入 28800 個 Epi（HENSM）細胞、28800 個 PrE/ExEM（RCL）細胞以及 86400 個 TE（BAPJ）細胞。每個單獨微孔的細胞數為 120 個。
細胞以 2× 濃度並加入 20 µM ROCKi 進行製備，將 500 µl 細胞混合懸液以逐滴方式輕柔加入 AggreWell 板的每個孔中（終體積 1 ml，ROCKi 終濃度 10 µM）。將培養板以 100g 離心 3 分鐘，並在低氧條件（5% O
次日（第 1 天），從每孔中輕柔移除 900 µL 培養基，並以 1 ml 預平衡的聚集培養基（N2B27-BSA）進行替換。第 2 天同樣更換等體積培養基。在聚集第 3 天，將聚集體輕柔轉移至 6 孔細胞懸浮培養板（Greiner, 657185）中，每孔加入 3 ml 預平衡的 EUCM2（20% FBS），並置於軌道搖床上以 60 rpm 轉速振盪培養（Thermo Scientific 88881102 + 88881123），搖床位於 5% CO
人源類囊胚按照 Kagawa 等人的方法生成。
小鼠 SEM 聚集按照 Tarazi 等人的方法制備。
適當人類發育的評估通過對現有資料的仔細分析進行。
本文所使用的大多數人類組織學描述和圖像均見於 virtual human embryo 網站。
本研究中所納入的所有人類宮內數據和圖像均僅取自 Carnegie 館藏，並已獲得相應的版權批准（審批進行中）。僅將呈現此前定義的全部特徵的 SEM 視為發育適當。人類 SEM 的生成百分比基於獨立實驗中在特定時間點隨機視野下觀察到的發育適當結構數量進行計算，同時始終依賴免疫熒光來證實三胚層譜系的貢獻。
即時 PCR 的統計分析在 QuantStudio 軟件 v1.3 中完成，並在 GraphPad Prism 7 中進行可視化。細胞數量和 SEM 效率的可視化及統計分析使用 Python 3.8.5 軟件並結合 scipy 和 seaborn 庫完成。箱線圖表示中位數和四分位距，須線標示分佈範圍。柱狀圖顯示平均值加標準差。散點表示用於數據分佈可視化和分析的各個獨立數值。對於非正態分佈數據，兩組樣本間的顯著性差異采用雙側 Mann-Whitney 檢驗進行評估。
p < 0.05 被視為具有統計學顯著性。
細胞在室溫（RT）下於 PBS 中用 4% 多聚甲醛固定 10 min。隨後，樣品用 PBS 清洗 3 次，在 PBST（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）中通透 10 min，在 PBS/0.05% Tween/5% 胎牛血清/1% 牛血清白蛋白中封閉 1 h，並於 4°C 下用封閉液稀釋的一抗孵育過夜。
隨後，細胞用 PBS/0.05% 清洗（3 次，每次 5 min），並與用封閉液按 1:200 稀釋的 Alexa Fluor（488、568 和/或 647）偶聯二抗（Jackson ImmunoResearch）孵育。樣品隨後在室溫下用 1 μg/ml DAPI 復染 10 min，用 PBS 清洗 3 次（每次 5 min），並用 Shandon Immuno-Mount（Thermo Scientific）封片。
用於細胞免疫熒光的抗體及其稀釋度如下：兔多克隆 anti-Cdx2（Cell Signaling，Cat# 3977），1:200；小鼠單克隆 anti-Cdx2（Biogenex，Cat# MU392A-UC），1:200；兔多克隆 anti-Gata4（Abcam，Cat# Ab84593），1:120；兔單克隆 anti-Foxa2（Abcam，Cat# Ab108422），1:100；山羊多克隆 anti-Sox17（R&D，Cat# AF1924），1:200；小鼠單克隆 anti-Oct4（clone C-10）（Santa Cruz，Cat# SC-5279），1:200；兔單克隆 Cdx2（Abcam，Cat# ab76541），1:200；山羊單克隆 Tfap2c（R&D，Cat# AF5059），1:200；兔單克隆 Cytokeratin 7（Abcam，Cat# ab181598），1:200；兔單克隆 Cytokeratin 7（Abcam，Cat# ab68459），1:200；兔單克隆 Nanog（Abcam，Cat# ab109250），1:200；小鼠單克隆 Gata3（Invitrogen，Cat# MA1-028），1:200；山羊多克隆 Gata3（R&D，Cat# AF2605），1:200；小鼠單克隆 HCG-Beta（Abcam，Cat# ab9582），1:200；兔單克隆 Gata6（Cell Signaling，Cat# 5951），1:200；山羊多克隆 Oct3/4（R&D，Cat# AF1759），1:200；山羊多克隆 Gata6（R&D，Cat# AF1700），1:200；兔單克隆 Syndecan1（Abcam，Cat# ab128936），1:500；兔單克隆 PDGFR-A（Abcam，Cat# ab134123），1:100；山羊多克隆 Nidogen2（R&D，Cat# AF3385），1:100。
流式細胞術分析在 BD FACS-Aria III 上進行。細胞用 TrypLE 收集，並用 PBS 清洗一次，隨後在 100 ul PBS/0.5% BSA 中加入偶聯的一抗（5 ul）孵育半小時。
所使用的一抗如下：小鼠單克隆 TROP2-488 標記抗體（R&D，Cat# FAB650G）；小鼠單克隆 TROP2-PE 標記抗體（R&D，Cat# FAB60P）；小鼠單克隆 CD249（ENPEP）-BV421 標記抗體（BD，Cat# 744872）；大鼠單克隆抗小鼠 CD140a（PDFGR-a）-PE/Cy7 標記抗體（BioLegend，Cat# 135912）；小鼠單克隆抗人 CD140a（PDFGR-a）-PE/Cy7 標記抗體（BioLegend，Cat# 323508）；小鼠單克隆抗人 CD140a（PDFGR-a）-APC 標記抗體（BioLegend，Cat# 323512）。
採用 FSC 和 SSC 對單細胞進行門控，且所有分析僅納入單個細胞。採用未染色對照來確定所有抗體的陰性/陽性群體，確保未染色群體的 100% 被劃分到直方圖/點圖的陰性區域。
免疫熒光圖像使用 Zeiss LSM 700 以及 LSM 800 倒置共聚焦顯微鏡（Zeiss）採集，兩者均配備 405 nm、488 nm、555 nm 和 635 nm 固態激光器，並使用 Plan-Apochromat 20× 空氣物鏡（數值孔徑 0.8）或 EC Plan Neofluar 10× 空氣物鏡（數值孔徑 0.3）。有關成像參數的詳細說明，見
免疫熒光圖像使用 Zeiss Z7 光片顯微鏡採集，該設備配備 405 nm、488 nm、561 nm 和 638 nm 激光器，使用單個水浸 20× Plan-Apochromat 檢測物鏡（數值孔徑 1.0，Zeiss）以及兩個空氣 10× Plan-Apochromat 照明物鏡（數值孔徑 0.2，Zeiss）。每次對單一樣本進行成像，樣本包埋於成像腔室內 PBS 中的 1% 低熔點瓊脂糖中。沿 Z 軸的光片體積數據以雙掃描模式採集，並採用樞軸掃描。
光片厚度設定為 3.77 µm，激光功率設定在 1–50% 範圍內。幀大小為 1920×1920 px，曝光時間為 50 ms。針對每個通道，左側和右側照明的光片均根據檢測透鏡焦平面中的信號強度，在樣本體積內獨立調節。另見
第 6 天后，人類 SEM 可繼續保存在子宮外電子控制滾軸培養平台中
按照生產商說明，使用 RNeasy mini kit（Qiagen）分離總 RNA。隨後，取 1 μg 總 RNA，使用 High-Capacity Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）進行反轉錄。RT-PCR 採用 SYBR Green PCR Master Mix（Qiagen）進行三重複檢測，並在 Viia7 平台（Applied Biosystems）上運行。所有實驗中的數值均以 Actin 和/或 Gapdh 進行標準化。
數據表示為相對於參考樣本的倍數差異，參考樣本設定為 1。所使用的 RT-PCR 引物列表見
在子宮外培養條件下生長的人類 SEM 經手工挑選並收集，用於單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）
10x Genomics 數據分析採用 Cell Ranger 7.1.0 軟件（10x Genomics）對原始測序數據進行預處理，並使用 Seurat 4.3.0 進行下游分析。為去除低表達的單細胞、10x 樣本處理過程中可能產生的雙細胞，以及線粒體表達比例過高的單細胞，我們過濾掉了表達基因數少於 1000 個、表達基因數超過 8,000 個以及線粒體基因表達比例超過 15% 的細胞。
隨後，對所有單個樣本進行 Seurat 整合分析與錨定，並採用尺度因子為 10,000 的對數歸一化方法進行標準化。通過方差穩定轉換方法識別出前 2,000 個高變基因，並進一步進行縮放和中心化處理。採用主成分分析對維度進行評估，並使用“elbow”方法確定主成分數。前 10 個維度顯示了數據變異性的主要部分。因此，在所有樣本中基於前 10 個維度進行 UMAP 降維。使用 Seurat 的 Find Clusters 函數檢測聚類，分辨率參數設為 0.5。
使用 Seurat DotPlot() 函數生成描述特定基因表達及其普遍性的點圖。利用 Seurat FeaturePlot() 函數生成所選基因在 SEM UMAP 上的投影圖。
人類胚胎參考圖譜通過整合先前發表的數據集構建，這些數據集包括 5 個人類胚胎數據集，涵蓋體外培養的人類囊胚。
選取 Rhox5 陽性細胞（>1 counts）用於胚外組織分析。細胞依據標誌基因進行註釋，與此前在……中所採用的方法一致。
所選基因（GATA3、GATA4、GATA6）鄰近區域的 bulk ATAC-seq 和 RNA-seq 圖譜使用 IGV 基因組瀏覽器展示。小鼠數據集取自已發表的數據集。
所有 scRNA-seq 數據已提交至 GEO：XXXXXXXXX。
重新分析本研究所報道數據所需的任何其他資訊，可根據請求向通訊作者取得。
J.H.H 實驗室的經費來源包括 Pascal and Ilana Mantoux；Flight Attendant Medical Research Institute（FAMRI）；MBZUAI-WIS Program、ISF；Minerva、Israel Cancer Research Fund（ICRF）、Kimmel Stem Cell Research Center，以及 Renewal Bio Ltd. 資助的研究項目。
F.L. 實驗室獲得 Ming Wai Lau Center for Reparative Medicine、Ragnar Söderbergs Stiftelse、Wallenberg Academy Fellow、Center for Innovative Medicine 以及 Karolinska Institutet SFO Stem Cells and Regenerative Medicine 的支援。
S.P. 實驗室獲得 Swedish Research Council 和 Swedish Society for Medical Research 的支援。S.P. 擔任 Canada Research Chair in Functional Genomics of Reproduction and Development（950-233204）。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.14.544922
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