在多細胞系統中，無法以可擴展且精確的方式測量發育增強子的活性，是基因組學中的一個瓶頸。在此，我們開發了一種雙RNA盒式系統，將多重單細胞報告基因檢測中固有的檢測與定量任務解耦，從而能夠在超過10,000倍的活性範圍內準確測量報告基因表達，其精度接近由泊松計數噪聲所設定的極限。結合RNA條形碼環化，這些
發育增強子指導基因表達程序的展開，並表現出顯著的細胞類型特異性和時空特異性。這種嚴格調控構成了形態與功能從單細胞合子穩健湧現的基礎。靶基因的精細調控變化，即使僅由單個增強子中的單核苷酸改變所引起，也既可能導致疾病（
在哺乳動物系統中，大多數對順式調控元件（CRE）的高通量功能研究都是在靜態環境中進行的，通常採用癌細胞系（
迄今為止，多細胞系統中關於增強子的研究主要通過轉基因報告基因進行，並通過
近來的兩項創新有望提高哺乳動物發育增強子生物學研究的通量。
為解決這一問題，我們開發了一種雙RNA報告基因盒式系統，將檢測與定量任務分離開來（
我們推測，可以通過連接於單個報告基因上的兩種分別帶有條形碼的RNA，將檢測與定量解耦（
雙RNA報告基因需要連續產生兩種彼此分離的RNA，這可能會干擾CRE功能。鑑於Pol II啟動子可以充當增強子（
為減輕短異位Pol III RNA的不穩定性（
我們首先確認，scQers能夠以約2%的缺失率在單細胞中報告轉錄活性，並在較大的動態範圍內表現出很高的準確性（<10
oBC在每個細胞基礎上都能被穩健捕獲。特別是，oBC唯一分子標識符（UMI）計數的分佈呈現雙峰性（
對單細胞與總體定量所得報告基因表達的比較證實了scQers的準確性。在利用oBC檢測到報告基因整合之後，同一oBC-啟動子-mBC三聯體在每個細胞中發生多重整合的概率低於5%（
如果不進行過濾，偽性讀段計數會改變報告基因定量。實際上，文庫製備需要若干擴增步驟，這些步驟可能產生“嵌合”擴增子，並導致虛假的細胞—條形碼連接。在飽和文庫中，這類分子產物的特徵是低於約10 UMI/細胞的計數頻率升高（例如，oBC：
除了評估oBC缺失率之外，我們的細胞克隆池還使我們能夠量化mBC捕獲的變異性。多次出現的克隆為整合於固定基因組位置上的同一組報告基因提供了內部重複測量，從而控制了隨機整合盒式系統的一個重要變異來源（
克隆分析還揭示了由位置效應驅動的報告基因表達變異（假設不同克隆中的報告基因整合於不同的基因組位置）。我們觀察到啟動子和細胞系特異性的效應，其中 EEF1A1p 和 UBCp 表現出極低的克隆間變異（各克隆間四分位距，UBCp：所有細胞系中均 <2.4；EEF1A1p：在 K562 和 HEK293T 中 <1.5，在 HepG2 中為 4.1）。
相比之下，啟動子 Pgk1p 不僅表現出細胞系間的表達差異（例如，HEK293T 中標準化 mBC UMI 的中位數為 12，而 K562 中為 76），還表現出更高的克隆間變異性（HEK293T 中 IQR 為 4.8，K562 中為 5.9，HepG2 中為 7.2）。
將 mBC UMI 的變異性分解為位置效應（通過克隆歸屬評估）與其餘生物學和技術噪聲之和後表明，測量精度受限於基因組背景，這既凸顯了我們捕獲過程的低變異性，也強調了對多個獨立整合位點取平均的重要性（可歸因於克隆身份的 mBC UMI 方差比例：EEF1Ap=0.60，Pgk1p=0.41，UBCp=0.57，
在細胞系中經過廣泛優化後，我們嘗試將 scQers 應用於發現
mEBs 可重複地包含多種細胞類型，並能夠被明確映射到
scQers 在 mEBs 中表現出高性能。首先，oBC 被穩健捕獲（文庫複雜度中位數 = 836 UMI/oBC/細胞），且 oBC UMI/細胞呈雙峰分佈（
scQer 生成了高對比度的 CRE 活性單細胞圖譜（
活性 CRE 在 mEB 細胞類型間表現出不同的表達模式。通過置換檢驗將活性 CRE 分類為細胞類型特異性或非特異性（
我們的檢測方法依賴於高 MOI 條件下報告基因的隨機整合以實現可擴展的多重檢測，這引發了一個擔憂，即基因組位置效應可能主導所觀測到的信號（
在鑑定出的 10 個自主性細胞類型特異性增強子中，有 2 個屬於核心
由發育性 CRE 驅動的報告基因表達，重現了其鄰近推定關聯基因的主要表達模式（
在所測試的全部 103 個遠端頂壁內胚層元件中，8 個活性細胞類型特異性增強子富集了若干特徵。活性 CRE 表現出更高的染色質可及性（可及性提高 1.8 倍，差異可及性提高 2.2 倍，兩者均為 p<0.03，經 B-H 校正的單側 t 檢驗），但在進化保守性方面未顯示差異（平均 phyloP 評分（
總體而言，scQers 實現了對 21 天小鼠 EBs 多種細胞類型中組成型啟動子樣調控元件和譜系特異性自主活性調控元件的可擴展、高靈敏度表徵，且增強子活性譜與其推定關聯基因的表達相一致。
增強子被認為能夠協調後生動物發育過程的精確展開，使物種的形態與功能得以從基因組藍圖中產生。然而，至少迄今為止，我們大規模研究發育增強子的能力仍受到限制，尤其是在哺乳動物系統中。一方面，
我們的篩選中相對較低的增強子命中率表明，在測量之前先進行基因組整合並隨後誘導分化，為那些具有自主能力、能夠重構染色質化景觀的元件提供了強有力的篩選。事實上，如應用於其他模型系統的染色體外檢測可以報告更高比例的活性元件（
單細胞檢測相較於在多種細胞系中進行多次群體檢測有何優勢？發育系統呈現出一種連續的狀態譜系，這與不連續的終末狀態形成對比。沿着發育流形構建增強子活性圖譜，有望揭示環境中細微變化的影響
本研究獲得美國國家人類基因組研究所（NHGRI）研究基金資助（UM1HG011966授予JS，R01HG010632授予JS和CT）。JBL為達蒙·魯尼恩癌症研究基金會研究員（DRG-2435-21）。SGR獲得NHGRI資助（F31HG011576）。DC獲得美國國家心肺血液研究所資助（T32HL007828）以及NHGRI資助（F32HG011817）。JS為霍華德·休斯醫學研究所研究員。
JBL和SGR提出了雙報告系統的概念。JBL構建了scQer文庫，設計並開展了在人類細胞系中的實驗以及Pol III MPRA實驗。SGR和JBL設計並開展了mEB中的實驗。JBL分析數據、製作圖表，並在JS修改及SGR和DC提出意見的基礎上撰寫了手稿。SGR生成了mEB中的scATAC數據。SGR和SD構建了mESC細胞系，建立了mEB實驗方案，並完成了mEB的早期圖譜分析。BM提供了用於MPRA盒克隆的構建體和實驗方案。DC提出了分析建議，並提供了用於子組裝的計算機腳本。
TL對CRE進行了生物資訊學分析。CCS提供了文庫子組裝的初始實驗方案。CL提供了FACS方面的協助。CT和JS監督了本研究。
J.S.是Cajal Neuroscience、Guardant Health、Maze Therapeutics、Camp4 Therapeutics、Phase Genomics、Adaptive Biotechnologies、Scale Biosciences、Sixth Street Capital和Pacific Biosciences的科學顧問委員會成員、顧問和/或聯合創始人。其餘作者聲明不存在競爭性利益。
本研究產生的原始測序數據和處理後的文件已提交至GEO，登入號為GSE217690。用於分析的代碼和腳本已存儲於github（
B 不同特徵在分類任務（特異性 vs. 非特異性/非活性）中的受試者工作特徵（ROC）曲線。Gata4 轉錄因子結合位點（TFBS）的密度、對應的 ATAC 可及性以及 ATAC 信號的倍數變化，均具有良好的預測價值，可用於區分功能元件（auROC > 0.7）。邏輯迴歸分類器（
我們感謝 N. Ahituv、M. Kircher、R. Ziffra、G. Gordon、A. Ellis、J. Tome 以及整個 Shendure 實驗室的討論；感謝基因調控分組的參與者（F. Chardon、W. Chen、X. Li、T. McDiarmid）提出的批評與建議；感謝 T. McDiarmid 指出未形成複合物的 sgRNA 具有很高的不穩定性。
質粒 pAV-U6+27-Tornado-Broccoli 由 S. Jaffrey 慷慨贈予（Addgene 質粒編號：124360）。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.12.10.519236
🏷️ 發育增強子 單細胞轉錄組 報告基因系統 順式調控元件 RNA條形碼