對培養胚胎的研究為認識人類圍植入期發育提供了重要見解。然而，關於圍植入期譜系發育及其潛在機制的詳細認知仍然不清楚。在本研究中，我們利用三維培養的人類胚胎，報道了早期植入後譜系的完整細胞圖譜，並解析了上胚層及下胚層衍生譜系的細胞組成和基因特徵。此外，我們通過組裝初始態人胚胎幹細胞（naive hESCs）和胚外細胞，構建了一種類胚組裝體（E-assembloid）。利用人類胚胎和E-assembloid，我們揭示了WNT、BMP和Nodal信號通路以協同但功能各異的方式調控人類圍植入期譜系發育。
特別地，我們解析了胚外中胚層和胚外內胚層命運決定的潛在機制。最後，我們進一步開發了改良的E-assembloid，以重現原腸形成前人類胚胎中的上胚層和下胚層發育及組織結構。我們的研究結果為理解人類圍植入期發育提供了新的見解，而E-assembloid則為解析驅動人類胚胎發生的細胞行為和信號互作提供了有用模型。
在人類中，囊胚是一個由約200個細胞組成的中空球狀結構，在胚胎發育第6至7天（E6-7）植入子宮壁，從而啟動植入後發育。在晚期囊胚中，內細胞團（ICM）分化為下胚層（HB）和上胚層（EPI）：下胚層形成卵黃囊，而上胚層進一步分化為三種確定性胚層，構成胚體本身。儘管這兩種譜系在人類發育中具有關鍵作用，但我們對於HB和EPI譜系植入後發育的認識仍然非常有限。近年來，我們及其他研究者已成功開發出
利用人類胚胎研究圍植入期發育面臨諸多倫理問題，同時也受到技術障礙的限制，例如特定譜系中的遺傳操作以及胚胎發育的可重複性
為填補人類圍植入期發育知識空白，在本研究中，我們利用三維培養的人類囊胚提供了早期植入後胚胎譜系的完整細胞圖譜。此外，我們成功構建了一種人類類胚組裝體（E-assembloid），其重現了人類圍植入期胚胎的發育里程碑、三維細胞組織結構和譜系組成，從而建立了一種用於研究人類早期植入後發育的新型胚胎模型。利用人類胚胎和E-assembloid，我們的研究揭示了HB和EPI衍生譜系的轉錄狀態，以及WNT、BMP和Nodal信號通路在介導其譜系決定中的功能作用。
儘管圍植入期人類胚胎中的一些細胞類型近期已得到表徵
單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據來自10x Genomics平台。
隨後，我們分析了這些譜系的基因表達特徵，並鑑定出有助於區分著床前後人類發育過程中不同細胞類型的分子標誌物。正如預期，PostE−EPI 和 PostL−EPI 均表達核心多能性基因。
我們進一步對 E13 人胚胎進行了免疫染色，並證實 XEN 細胞對 GATA6、SOX17、FOXA1、PODXL1、N-Cadherin 和 OTX2 呈陽性，而 ExM 細胞對 GATA6、KDR、SNAIL 和 COL3A1 呈陽性，但對 SOX17、FOXA1、PODXL1、OTX2 或多能性標誌物呈陰性（補充資訊，圖 S1f，g），這與 scRNA-seq 數據一致（
我們還進行了 KEGG 通路分析，以揭示參與譜系發育的信號通路。AME、PS、ExM、VE/YE 和 AVE 簇富集了與 BMP 和 WNT 信號通路相關的基因（
為了模擬著床後 HB 和 EPI 譜系發育，我們嘗試使用 naive hPSCs 建立一種胚樣體，這些細胞是
隨後，我們嘗試將 AIC-N hESCs 與人滋養層幹細胞（hTSCs）進行聚集
WNT 和 BMP 信號通路在人類早期胚胎發育中發揮關鍵作用
接下來，我們檢測了 E-assembloids 的發育潛能。在 M1 條件下，包埋於 Matrigel 液滴中的 E-assembloids 體積逐漸增大（
與 E-assembloids 相比，大多數在 M1 條件下單獨培養的 AIC-N hESC 細胞團即使在 D9 仍維持多能性（補充資訊，圖 S4k，l），這表明存在來自 SNCs 的誘導信號以驅動 E-assembloid 的發育。由於 SNCs 表達 WNT 和 BMP 配體（補充資訊，圖 S4c），且 ExM、PS 和羊膜的命運決定與 WNT 和 BMP 信號密切相關
即使在調控 WNT 和 BMP 信號並延長培養時間的條件下，E-assembloids 和 AIC-N hESC 細胞團仍未產生 XENLCs（
基於胚內和胚外譜系命運決定涉及 WNT、BMP 和 Nodal 信號通路的原理（
在 D8 時，超過 90% 的 E-assembloids 含有兩個擴增的腔室，即卵黃囊樣結構和羊膜腔樣結構，其周圍被 ExMLCs 包圍（
為了進一步表徵 D8 的 E-assembloids，我們對三維培養的人胚胎與 D8 E-assembloids 的整合 scRNA-seq 數據進行了比較轉錄組分析（補充資訊，圖 S7a）。
UMAP 圖及滋養層和羊膜標誌基因的差異表達顯示，SNC 與 TrB 群體之間存在明顯差異（補充資訊，圖 S7a，b），但人胚胎與 E-assembloids 中 HB 和 EPI 相關譜系的組成相似，包括 postE-EPI、postL-EPI、UC、AME2、PS1/2、ExM1/2、VE/YE 和 AVE（
在本研究中，我們提供了一個完整的著床前後胚胎譜系細胞圖譜，並鑑定了 XEN 和 ExM 標誌物。我們的數據可作為有用資源，用於評估人胚胎模型以及胚內/胚外譜系。
利用3D培養的人類胚胎和E-assembloid，以及AIC-N hESCs的2D和3D分化體系，我們系統性解析了WNT、BMP和Nodal信號通路對PS、AME、ExM和XEN命運決定的作用，並闡明瞭XEN和ExM命運決定的潛在機制（
我們的研究存在若干侷限性。首先，影響胚外細胞（xEMs）包裹naive hESC細胞團能力的機制尚未揭示。既往研究提出，組織形態發生過程中穩健的模式形成源於基於由形態發生素指導的梯度所指示的組合性黏附編碼的細胞自組織
總之，本研究為推進人類胚胎學與生殖學認知提供了重要資訊，而E-assembloid為未來探索人類圍植入期發育過程中的譜系多樣化、信號相互作用和組織圖式形成提供了有用模型。
T.L.和W.J.發起了該項目。T.L.監督了整個項目。T.L.和Z.A.設計了實驗並撰寫了手稿。T.L.指導Z.A.、Y.Y.、K.D.和B.N.開展數據分析。Z.A.、B.N.、Y.Y.、S.W.、Y.H.、C.Z.、C.Z.、R.K.、T.C.、W.L.、N.L.和S.Z.進行了幹細胞分離與培養、類胚體組裝與鑑定、培養體系開發以及機制研究。L.X.、G.S.、L.R.、X.M.、Y.L.和Z.W.進行了人類胚胎培養。Y.Y.、Z.A.、K.D.、Y.G.和W.L.分析了測序數據。
Y.Z.和J.F.參與了測序數據分析和手稿準備工作。
作者聲明不存在競爭性利益。
關於人類胚胎以及從人類囊胚建立新幹細胞系的研究是我們既往工作的延續
為控制囊胚的變異性，我們在使用前對胚胎質量進行了評估。根據Gardner評分系統
在本研究中，根據先前建立的兩項標準，選擇3D培養的人類胚胎進行10x測序：1）在培養過程中出現明顯擴張；2）無明顯細胞死亡或碎裂表型
囊胚被接種於經絲裂黴素C（Sigma，M0503）滅活的小鼠胚胎成纖維細胞（Millipore，PMEF-CFL）飼養層細胞（以下簡稱 feeders）上。48小時後，在已貼壁的胚胎中可見類 hESC 外生長物，並將其機械轉移至 50% TrypLE（Thermo Fisher Scientific，12605-028）中，於 37℃孵育 10–15 分鐘。或者，如果類 hESC 外生長物不可見，則將整個貼壁胚胎用 50% TrypLE 於 37℃孵育 10–15 分鐘。
隨後，將消化後的類 hESC 外生長物（或整個胚胎）轉移至一滴 AIC-N 培養基中，並用精細拉制的巴斯德吸管輕柔上下吹打，使其解離為單細胞。所有解離得到的單細胞均分散接種至 feeders 上。3–5 天后，可觀察到一些明顯的 naïve hESC 集落，並進一步採用 50% TrypLE 將其解離為單細胞進行傳代。常規情況下，AIC-N 培養基每 2 天更換一次，新建立的 AIC-N hESC 細胞系每 3–4 天按 1:5–1:10 的比例傳代一次。
在 AIC-N hESC 的建系與維持過程中，AIC-N 培養基中補充 10 μM Y27632（Selleck，S1049）。本研究中，AIC-N hESC 已在穩定的 naïve 狀態下維持超過 50 代。
AIC-N 培養基由改良的 N2B27 培養基組成，並補充 10 ng/ml Activin-A（Peprotech，120-14E）、2 μM IWP2、0.3 μM CHIR99021（Selleck，S2924）、1 μM PD0325901（Selleck，S1036）、2 μM Gö6983（TOCRIS，2285）以及 10 ng/ml 重組人 LIF（Peprotech，300-05）。
500 ml 改良 N2B27 培養基由以下成分組成：240 ml DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific，10565-018）、240 ml Neurobasal（Thermo Fisher Scientific，21103-049）、5 ml N2 supplement（Thermo Fisher Scientific，17502-048）、10 ml B27 supplement（Thermo Fisher Scientific，17504-044）、0.5% GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，35050-061）、1% 非必需氨基酸（NEAA，Thermo Fisher Scientific，11140-050）、0.1 mM β-巰基乙醇（Sigma，M7522）、0.38 ml 7.5% BSA（Sigma，A1933）、50 μg/ml L-抗壞血酸 2-磷酸酯（Sigma，A8960）、0.5 ml 化學成分限定脂質濃縮液（Thermo Fisher Scientific，11905-031）、12.5 μg/ml 胰島素（Roche，11376497001）、1.25 ml 丙酮酸鈉（Thermo Fisher Scientific，11360-070）、0.02 μg/ml 孕酮（Sigma，P8783）。
採用常規條件培養的 primed hPSCs（CC-hPSCs，KSR/bFGF 培養基）經 50% TrypLE 消化為單細胞，並以 3×10 的密度接種
為重置人 CC-hPSCs，將單個 CC-hPSCs 以 8×10 的密度接種
囊胚來源 hTSC 細胞系的建立與培養按照已發表的方法進行
nTEs（naïve hESC 來源的滋養外胚層樣細胞）的分化按照先前已發表的方法進行
hTSCs 的分化按照所述方法進行
AIC-N hESC 來源 hTSCs 向 STBs（合體滋養層細胞；2D 和 3D）及 EVTs（絨毛外細胞滋養層細胞）分化的方法按照先前報道的方法進行
在Matrigel包被的培養皿/培養板上生長的AIC-hPSCs按照前述方法在AIC培養基中進行培養。
為生成BMP4誘導細胞（BICs），採用50% TrypLE將AIC-hPSCs消化為單細胞，並以1×10的密度接種。
BICs向成熟滋養層細胞的分化按照已發表的方法進行。
對於WNT、BMP和Nodal信號在XENLCs和ExMLCs命運決定中的功能實驗，將AIC-N hESCs以1500/孔-96孔板的密度接種於飼養層上，並置於所示分化條件下培養（
經預驗證的靶向第3外顯子的gRNA序列為
畸胎瘤實驗按照NIH指南和動物操作規範進行，並經雲南省靈長類生物醫學研究重點實驗室動物護理與使用委員會預先批准。約10
細胞在傳代前一天用於進行核型分析。以新鮮培養基孵育2–4小時後，採用Colcemid溶液（BI，12-004-1D）處理細胞，終濃度為0.02 μg/ml，處理1小時。隨後用PBS清洗細胞兩次，消化為單細胞並離心。接着，將細胞沉澱重懸於5 ml低滲溶液（0.075 M KCl）中，於37℃放置15分鐘。向低滲懸液中逐滴加入1 mL冰冷固定液（甲醇:乙酸 = 3:1），並於室溫放置5分鐘。離心並棄去上清後，向懸液中逐滴加入5 ml冰冷固定液，於室溫放置30分鐘後再次離心。固定步驟重複三次。
最後，將細胞沉澱重懸於終體積為3 ml的冰冷固定液中，並置於–40℃冰箱中保存。後續G顯帶核型分析在中國昆明雲南省第一人民醫院進行。每次分析至少計數20箇中期分裂相。
類囊胚形成按照先前描述的方案進行。
將AIC-N hESC集落暴露於1 mg/ml IV型膠原酶中60–90分鐘，使其從飼養層上脱離。收集脱離的集落，採用50% TrypLE將其解離為單細胞，經20 μm細胞濾網過濾後，以1000 rpm離心4分鐘使其沉澱，隨後重懸於AIC-N培養基中，並使用血細胞計數板進行計數。按照製造商說明書準備AggreWell™ 400 24孔板。取500 μl細胞懸液（包括3×10
將人E-assembloid從微孔中轉移至預冷並置於冰上的1.5 mL微量離心管中。約10 min後，吸除上清，加入冰冷的M1與Matrigel（Corning, 354230）按1:2配製的混合物重懸沉澱，使終濃度達到600個E-assembloid/mL。
充分混勻後（為確保E-assembloid在懸液中均勻分佈，每個1.5 mL微量離心管中的懸液體積不超過300 μL，並在滴加至3.5 cm培養皿的過程中充分混勻），將10–20 μL/滴的E-assembloid懸液接種於3.5 cm培養皿中（每皿約20滴），迅速將培養皿倒置以防止E-assembloid沉降至液滴底部，在37℃下凝固20 min後，每皿覆蓋2 mL預溫的M1培養基。
在整個包埋過程中，Matrigel、培養基和離心管始終置於冰上；所有用於人E-assembloid包埋和培養的培養基均補充10 μM Y27632。除非另有說明，常規每兩天更換一次培養基。對於人E-assembloid的延長培養，在指定時間範圍內，基於M1條件進行IWP2/LDN添加以及CHIR/A83-01/SB431542撤除，並建立了兩種E-assembloid組裝與延長培養方案（
AIC-N hESC團塊按“人胚樣體生成”部分所述方法制備。在團塊形成後，大部分AIC-N培養基被移除，並向每孔Aggrewell中輕柔加入2 mL指定培養基。在16–20 h內，將這些AIC-N hESC團塊從微孔中轉移出來，並按上述“3D包埋”培養方法進行培養。簡言之，將這些AIC-N hESC團塊轉移至預冷並置於冰上的1.5 mL微量離心管中。約10 min後，吸除上清，加入冰冷的指定培養基與Matrigel按1:2配製的混合物重懸沉澱，使終濃度達到1000個團塊/mL。
將10–20 μL/滴的AIC-N hESC團塊懸液接種於3.5 cm培養皿中（每皿約20滴），在37℃下凝固20 min後，每皿覆蓋2 mL預溫培養基。在整個包埋過程中，Matrigel、培養基和離心管始終置於冰上；所有用於AIC-N hESC團塊包埋和培養的培養基均補充10 μM Y27632。除非另有說明，常規每兩天更換一次培養基。在延長培養期間，AIC-N hESC團塊在M1條件下單獨培養至不同時間點（補充資訊，圖S4k）。
對於WNT和BMP信號通路的功能實驗，根據指定組合，在不含CHIR99021的M1培養基中加入CHIR99021（3 μM）、BMP4（20 ng/mL）、LDN（200 nM）和IWP2（2 μM）（
AIC-N hESC細胞團按照“人類胚樣體的構建”部分所述方法制備。接種後24 h，將這些已形成的AIC-N hESC細胞團從微孔中轉移出來，並按照上述“3D包埋”培養方法，在所示條件下培養6天（補充資訊，圖S6j）。基礎培養基由添加10 μM Y27632的改良N2B27培養基組成。為誘導WNT和BMP信號通路，在延長培養的前12 h內，使用CHIR99021（2 μM）和BMP4（1 ng/ml）處理AIC-N hESC細胞團（補充資訊，圖S6j）。
在本研究中，我們通常使用傳代20–40代的AIC-N hESCs構建胚樣體，且未觀察到由傳代次數引起的明顯差異。除非另有說明，細胞或胚樣體培養實驗均在21% O
為通過流式細胞術檢測細胞表面標誌物，將AIC-N hESC克隆經1 mg/ml IV型膠原酶處理60–90 min後從飼養層上分離，收集脱落的克隆，並用50% TrypLE將其消化為單細胞，隨後離心，並用含1% FBS（BI，04-001-1A）的預冷PBS清洗。
對於Tra-1-85的流式細胞術分析，細胞在4℃條件下與用含1% BSA的PBS稀釋的抗Tra-1-85抗體（Abcam，ab108308，1:100）孵育30 min，隨後再用AlexaFluor 555偶聯的驢抗兔IgG二抗（Thermo Fisher Scientific，A-31572，1:1000）染色30 min。
對於Tra-1-60和SUSD2，細胞在4℃條件下分別與用含1% BSA的PBS稀釋的PE偶聯抗Tra-1-60抗體（Thermo Fisher Scientific，12-8863-82，1:5）或PE偶聯抗SUSD2抗體（Biolegend，327406，1:100）孵育30 min。
相應地，分別使用正常兔IgG（Abcam，ab172730，1:100）、PE偶聯小鼠IgM（Thermo Fisher Scientific，MGM04，1:10）和PE偶聯小鼠IgG1抗體（BD Pharmingen，554680，1:100）作為同型對照。流式細胞術使用FACSAria III進行，數據採用FlowJo軟件分析。
本研究中所有貼壁生長的細胞均在室溫下用4%多聚甲醛（PFA）固定20 min，並用PBS清洗3次。對於D1時期的胚樣體（Aggrewell中的聚集體），將聚集體從微孔中轉移至預冷並置於冰上的1.5 mL微量離心管中。約10 min後，吸去上清，將聚集體重懸並在4□°C下用4% PFA固定3 h。對於“3D包埋”培養，胚樣體或hESC球體在4□°C下用4% PFA固定3 h，隨後轉移至1.5 mL微量離心管中。
所有結構（胚樣體或hESC球體）均用PBS清洗3次，在含20%蔗糖的PBS中於4□過夜脱水，包埋於O.C.T.（Sakura Finetek，4583）中，並使用Leica冷凍切片機切成厚度為10 μm的切片。經室溫下用含0.2% Triton X-100、100 mM甘氨酸和3% BSA的PBS透化並封閉60 min後，將細胞或切片與一抗在4□°C下孵育過夜，再用含0.05% Tween-20的PBS清洗3次，於室溫下與二抗孵育2 h，並再次用含0.05% Tween-20的PBS清洗3次。
DAPI（Roche Life Science，10236276001）用於細胞核染色。圖像由Leica SP8激光共聚焦顯微鏡採集。所用抗體列於
為評估被xEMs（hTSCs或nTEs或BICs/SNCs）包裹的AIC-N hESC細胞團的效率，對胚樣體冷凍切片分別進行OCT4和CK7染色，以分別標記AIC-N hESCs和xEMs。根據譜系標誌物的表達模式，這些結構被分為三種類型（
為定量不同類型細胞或胚樣體的比例，以及胚樣體中特定細胞類型的數量，對2D細胞培養物和不同類型胚樣體的冷凍切片使用所示標誌物進行染色。隨後使用共聚焦顯微鏡（Leica SP8）手動統計不同類型細胞或胚樣體的百分比，以及胚樣體中特定細胞類型的數量。統計分析和作圖使用GraphPad Prism 9完成。
為測量發育中E-assembloids的直徑，將不同時間點的E-assembloids用4% PFA固定，在Matrigel去聚合後使用相差顯微鏡隨機拍照。使用Image J軟件處理圖像並測量E-assembloids的直徑。統計分析和作圖使用GraphPad Prism 9完成。
貼壁生長的細胞（在 Matrigel 上培養的 BICs 和在 Col IV 上培養的 hTSCs）通過使用 50% TrypLE 消化為單細胞後收集。對於 AIC-N hESCs 以及在飼養層上培養的 hTSCs，通過用 IV 型膠原酶處理 60–90 min 使克隆從飼養層上脱離，並收集脱離的克隆。對於包埋於 Matrigel 液滴中的分化 AIC-N hESC 細胞團，將培養物在 4□ 條件下用 Cell Recovery Solution（Corning，354253）處理 1 h。
待 Matrigel 去聚合後，收集分化的 AIC-N hESC 細胞團。所有培養物均用 PBS 清洗兩次。採用 TRIzol™ Reagent（Thermo Fisher Scientific，15596018）提取 AIC-N hESCs、hTSCs、BICs 及分化 AIC-N hESC 細胞團的總 RNA。2×150 bp 雙端文庫使用 Illumina HiSeq X Ten 儀器進行測序。文庫構建和測序由 Annoroad Gene Technology 完成（
人滋養層細胞之間的相關性分析
雙端測序在 HiSeq X Ten 平台（Illumina）上進行。文庫構建和測序由 Annoroad Gene Technology 完成（
使用 FastQC（v0.11.8）（對雙端 150 bp 原始 reads 的測序質量進行了檢測
基於我們先前的工作和其他報道，對 3D 培養人胚胎的單細胞解離進行了優化
進一步分析使用 Seurat 軟件包（v 4.0.3）進行
對於來自 E-assembloids 的 10x Genomics 數據，
按照已發表的方法，對 3D 培養人胚胎和 E-assembloids 的細胞間通訊網絡進行了分析
統計檢驗在 GraphPad Prism 9 軟件和 Microsoft Office Excel 2019 中進行。在進行每項參數統計檢驗之前，均對數據的正態分佈和方差齊性進行了檢驗。在適當情況下，
本研究獲得了國家重點研發計劃（2022YFA1103100 和 2021YFA0805700）、國家自然科學基金（32130034、82192874 和 82160294）、國家重點研發計劃（2020YFA0112700）、雲南省科技重大基礎研究項目（202102AA100007、202001BC070001 和 2019FY002）、雲南省科學技術廳—昆明醫科大學聯合專項資金（202101AY070001-260 和 202301AY070001-298）的資助。
我們感謝 Yan Bi 分享 ALPPL2 抗體。我們感謝 Ran Yang 提供有關人胚胎單細胞解離和製備的詳細資訊。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.15.545180
🏷️ 人類胚胎發育 著床期 類胚組裝體 譜系分化 WNT/BMP/Nodal信號