彌合胚胎發生研究中的鴻溝：源自北婆羅洲猩猩的類囊胚作為人類發育模型
Nicole Tay、Qiuye Bao、Uma Kamaraj、Ying Ying Zeng、Ka Wai Wong 及另外11位作者
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https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-8154543/v1
本作品採用 CC BY 4.0 許可協議授權。
對靈長類早期胚胎發生的理解仍然受到倫理和技術限制的制約。為應對這一問題，我們建立了一種基於幹細胞的胚胎模型，來源於北婆羅洲猩猩（
人類胚胎發育是一個複雜且動態的過程，理解細胞如何組裝成功能性胚胎，對於揭示發育障礙的起源具有基礎性意義。
胚胎學研究長期以來高度依賴小鼠等模式生物，這些生物成本低廉且繁殖效率高。此類研究揭示了早期發育的基本原理。
為克服這些障礙，基於幹細胞的胚胎模型應運而生。最初的嘗試採用了來源於胚胎癌的擬胚體。
近年來，多能幹細胞（PSC）響應機械化學線索而自組織的能力，使“類囊胚”——模擬囊胚發育關鍵特徵的三維結構——得以構建。這些模型模擬了囊胚發育的諸多方面，並可在高通量條件下進行觀察和操控，從而為譜系分離、細胞力學、著床以及表觀遺傳調控提供複雜的時空層面洞見。
在人類中，類囊胚已可由部分重編程的成纖維細胞生成。
儘管具有潛力，人類類囊胚研究仍受到倫理和法律限制。儘管國際幹細胞研究學會（ISSCR）近期取消了限制胚胎研究的“一刀切”式“14天規則”。
非人靈長類（NHP）提供了一種有前景的替代方案。與人類模型相比，其倫理顧慮較少，樣本可獲得性更高，同時允許研究延伸至原腸胚形成及其後續階段。
在300多種靈長類物種中，大猿（Great Apes，科
關於猩猩（
在此，我們報道了首次成功由北婆羅洲猩猩（
為模擬植入前發育，我們採用 AggreWell 平台，對依賴飼養層、無足跡的誘導多能幹細胞（F
免疫染色證實了譜系分離，不同區域分別表達上胚層（EPI；OCT4、SOX2）、滋養外胚層（TE；GATA2、CDX2）以及原始內胚層/下胚層（PE/HYPO；SOX17、GATA4）標誌物（圖
為在單細胞分辨率下解析細胞身份，我們對210個猩猩類囊胚進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq），獲得了7,028個細胞的轉錄組。降維與聚類分析鑑定出7個轉錄上彼此不同的細胞群體（圖
相關性分析表明，猩猩類囊胚與人類類囊胚及E6期人類囊胚的一致性更高（圖。
值得注意的是，POU5F1 和 SOX2 在各簇中表現出異質性表達，這與它們在著床前發育過程中參與多種譜系的作用一致。
與單胚泡樣體類似，雙胚泡樣體表現出類似人類囊胚的空間組織結構，包括位於外圍的 GATA2+ 和 CDX2+ TE 樣細胞、位於中央的 SOX2+ EPI 樣細胞，以及 SOX17 PE/HYPO 樣細胞和類囊胚腔結構（圖。
為解析雙胚泡樣體內的譜系特化，我們對約 200 個聚集體進行了單細胞 RNA 測序，獲得了超過 8,000 個單細胞轉錄組。降維與聚類分析揭示了九個在轉錄上彼此不同的細胞簇（圖。
與紅毛猩猩胚泡樣體、人類胚泡樣體和人類囊胚的比較分析
天然囊胚可提供多能性幹細胞和滋養外胚層幹細胞（TSCs）。為評估紅毛猩猩胚泡樣體是否具有可擴增的幹細胞群體，我們鋪板培養了雙胚泡樣體
在 TSC 支援條件下培養時，雙胚泡樣體
總體而言，這些結果證實紅毛猩猩胚泡樣體能夠產生 ESCLC 和 TSCLCs，進一步驗證了其質量。
在著床過程中，囊胚的滋養層細胞附着於子宮壁，黏附後，內細胞團形成前羊膜腔，隨後啟動原腸形成
在附着後第 5 天，部分 TE 樣細胞顯示出 HLA-G 類似物和 CGβ 的陽性染色，這些標誌物與母胎耐受和妊娠早期維持相關（圖。
本研究首次成功建立了無整合的紅毛猩猩 iPSC，並進一步將其用於構建胚泡樣體。紅毛猩猩胚泡樣體由具有譜系代表性的細胞群組成，其轉錄組特徵類似於人類囊胚和人類胚泡樣體，並捕捉到了圍著床期發育的若干功能特徵，其轉錄組特徵類似於人類囊胚和人類胚泡樣體。值得注意的是，與獼猴模型相比，紅毛猩猩胚泡樣體與人類囊胚表現出更高的轉錄相似性，凸顯了其作為研究人類囊胚發育與著床的比較體系所具有的獨特價值。
相關實驗方案改編自開創性的人類胚泡樣體研究
雙胚泡樣體方案顯著優於單胚泡樣體條件。有趣的是，F
儘管紅毛猩猩胚泡樣體、人類囊胚和人類胚泡樣體之間的平均細胞數相當
胚泡樣體模型的一個持續性侷限在於譜系特化不完全。在不同物種中，胚泡樣體常常缺乏明確的 PE/HYPO 區室
胚胎模型中的細胞類型註釋在很大程度上受可用參考數據集的影響
囊胚樣體來源細胞的功能評估不僅限於形態學比較。由紅毛猩猩囊胚樣體產生的 ESCLC 和 TSCLC 與來源於囊胚的 ESC 和 TSC 相對應。與在很大程度上不具備向 TE 分化能力的小鼠 PSC 不同，人類及其他類人猿的 PSC 具有這種能力。
進一步通過植入實驗對其功能進行了驗證。
該紅毛猩猩囊胚樣體模型彌合了人類與非靈長類系統之間的關鍵空白。它為研究早期胚胎發生提供了一個在倫理上可行且在科學上穩健的平台，而無需破壞胚胎。儘管當前的人類囊胚樣體模型尚無法發育至早期階段之後，但未來的進一步進展可能最終擴展其發育潛能，並引發倫理考量。在此背景下，類人猿囊胚樣體構成了一種有價值的折中方案——既具有科學資訊價值，又在倫理上可行。
囊胚樣體系統——亦稱為整合型幹細胞胚胎模型、合成胚胎或類囊胚結構——為保護工作提供了獨特機遇。對於極度瀕危物種而言，由於天然胚胎稀缺或難以獲得，囊胚樣體可能為研究原本無法取得的發育階段提供前所未有的窗口。
在此，我們建立了首批無整合的 iPSC 細胞系，來源於
因此，整合型幹細胞胚胎模型可能拓展保護工具箱，使其超越人工授精、體外受精和體細胞核移植等技術；這些技術均受限於配子和胚胎的可獲得性。因此，幹細胞來源的囊胚樣體可能提供一種可擴展的替代方案，尤其是在利用冷凍保存的體細胞生成時，能夠從已死亡個體中恢復遺傳多樣性。
除其生成胚胎的潛力之外，囊胚樣體還可用於系統探索種間相容性、滋養層生物學以及宿主—代孕體相互作用，而這些對於推進跨物種輔助生殖技術至關重要。結合生物樣本庫計劃，基於 iPSC 的胚胎模型既可在當下保護受威脅分類群，也可為未來的生殖技術提供工具。
在生物多樣性危機不斷加速的背景下，基於幹細胞的胚胎模型不應僅被視為發育生物學的實驗平台，還應被視為保護工作的組成性工具。當與生殖技術和物種恢復策略相結合時，這些模型提供了一種面向未來的方法，並具有切實緩解生物多樣性喪失的潛力。
本項目已獲 Mandai Wildlife Group（MWG）研究委員會批准，項目編號為 MWG230104。本文稿準備過程中未對任何動物造成傷害。
分子與細胞生物學研究所——通過輔助生殖進行瀕危物種保護（IMCB-ESCAR）實驗室隸屬於萬態野生動物集團（Mandai Wildlife Group）。該集團是萬態野生動物保留區（Mandai Wildlife Reserve）的管理機構，旗下包括新加坡動物園（Singapore Zoo）、夜間野生動物園（Night Safari）、河川生態園（River Wonders）、飛禽樂園（Bird Paradise）和亞洲雨林探險園（Rainforest Wild Asia）。
皮膚樣本僅取自1只雌性北婆羅洲猩猩（
在屍檢時，取動物耳部皮膚，用70%乙醇清潔並剃毛，隨後對目標區域進行無菌外科準備。使用無菌手術刀片採集一塊3 cm × 3 cm的全層皮膚樣本。在無菌條件下，去除皮膚樣本上殘留的毛髮、脂肪和表皮，並將樣本切成更小的組織塊。經PBS清洗後，將組織塊置於含1× Antibiotic–Antimycotic（Gibco，15240062）的DMEM中，於室溫孵育30 min。
再次用PBS清洗後，將組織塊置於經0.1%明膠包被的無菌組織培養皿中，並在P0培養基中培養；P0培養基包含 Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）（Gibco，11966025）、20%胎牛血清（FBS）（Gibco，26140079）、1× Minimum Essential Medium（MEM）非必需氨基酸（NEAA）（Gibco，11140076）、1×青黴素–鏈黴素（Gibco，15140122）（相當於100 U/ml青黴素和100 µg/ml鏈黴素），以及2 mM L-谷氨醯胺（Gibco，A2916801）。
所有細胞培養均在37°C、5% CO
細胞計數使用Countess™3自動細胞計數儀（Invitrogen，AMQAX2000）進行，並通過人工複核。將600,000個成纖維細胞分別用各2 µg質粒 pCXLE-OCT3/4-p53shRNA、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL 和 pCXWB-EBNA-1 進行轉染（Addgene #27077、#27078、#27080 和 #37624，分別對應
將250,000個成纖維細胞接種於經0.1%明膠包被的3 cm培養皿中，並在FM培養基中培養。24 h後（第0天），使用CytoTune™-iPS 2.0試劑盒（Invitrogen，A16517）中的仙台病毒對成纖維細胞進行轉導，該試劑盒含有人源表達盒
鹼性磷酸酶染色使用Vector® Blue Substrate Kit（Alkaline Phosphatase）並按照製造商說明進行（Vector Laboratories，SK-5300）。
細胞以2.5 mg/ml 5-溴-2-脱氧尿苷和10 µg/ml秋水仙素處理過夜。隨後用0.5%胰蛋白酶–EDTA消化10 min，使細胞解離，收集至離心管中，並用5 ml低滲溶液處理20 min，該溶液含75 mM KCl和0.8%檸檬酸鈉。隨後使用3:1甲醇與乙酸固定液進行多次固定。G顯帶和染色體分析按照標準程序進行：將細胞懸液滴加於潔淨濕載玻片上並自然風乾，隨後置於90°C烘箱中，然後採用GTG顯帶技術染色；每個樣本分析20個細胞，並完成5個完整核型分析。
參考核型圖取自《哺乳動物染色體圖譜》。
iPSCs經傳代後，以1:3比例分種至超低吸附24孔板中。細胞在不含bFGF和hLIF的bFGF培養基中培養7天。形成的EB要麼繼續以懸浮狀態維持培養7天后收集用於RNA提取，要麼轉移至包被0.1%明膠的培養板上繼續培養7天后固定用於免疫染色。
囊胚樣體的直徑使用ImageJ（NIH，版本1.54f）進行測量。
為獲得ESCLCs和TSCLCs，收集囊胚樣體並接種於iMEF飼養層上，培養於補充10µM Y-27632的bFGF培養基中，或培養於滋養外胚層幹細胞（TSC）培養基中，並每日更換新鮮培養基（不含Y-27632）。
TSC培養基包含DMEM/F12 GlutaMAX、0.2%表徵型FBS（HyClone，SH30071.03）、0.3% BSA、0.1 mM β-巰基乙醇、0.5%青黴素-鏈黴素、1% ITS-X、0.5 mM VPA、50 ng/ml EGF、2 µM CHIR99021、1.5 µg/ml L-抗壞血酸、0.5 µM A83-01、1 µM SB431542、5 µM Y-27632。
ESCLCs和TSCLCs分別每4–6天使用ReLeSR™或TrypLE™進行傳代，並以1:10–20比例分種至各自對應的培養基中，培養基每日或隔日更換。共建立了4–8條ESCLC和TSCLC細胞系。
為評估合體滋養層樣細胞產生的絨毛膜促性腺激素（CG）的存在及濃度，收集IVC1和IVC2於
總RNA使用Monarch® Total RNA Miniprep Kit（New England BioLabs Inc.，T2010）提取，並採用iScript™ Reverse Transcription Supermix（Bio-Rad，1,708,840）逆轉錄為cDNA。qPCR採用KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix（2X）Universal（Kapa Biosystems，KK4618）進行，每個反應使用3.3 ng cDNA，引物終濃度為115 nM。
引物列於補充表1；其設計僅特異性識別預測的紅毛猩猩序列。樣本以重複孔或三重複進行檢測，並且
貼壁細胞用PBS清洗，懸浮類器官用PBS中的0.04% BSA清洗。固定採用4% PFA處理10–12 min。封閉在室溫下進行2 h；封閉液含有PBS中的2% BSA和0.3% Triton X-100。與一抗的孵育於4℃過夜進行，隨後用洗滌緩衝液中的0.1% Tween-20清洗。與二抗和DAPI的孵育在室溫避光條件下進行1 h。圖像使用熒光顯微鏡（Nikon ECLIPSE Ts2，4X、10X、20X）或倒置共聚焦顯微鏡（ZEISS LSM 700，10X、20X）採集。
熒光顯微圖像或共聚焦顯微圖像分別使用ImageJ或ZEISS ZEN Microscopy Software（blue edition）（RRID:SCR_013672）進行圖像疊加，並在必要時增強比例尺的可視化效果。抗體列於補充表2。對於囊胚樣體，每種免疫染色條件至少在10個囊胚樣體上進行。僅當所檢測囊胚樣體中有>50%顯示出類似囊胚的胚胎系與胚外系譜的空間定位時，才展示相關圖像。
對於單細胞RNA測序（scRNA-seq），210 F
獲得10X Genomics數據後，採用Cell Ranger（RRID:SCR_017344）程序在預設參數下並基於ponAbe3基因組進行比對和UMI計數。Cellranger生成的feature-barcode計數矩陣用於在R中結合Seurat開展下游分析。在質量控制過程中，表達基因少於500個或線粒體基因含量超過10%的細胞被視為異常並予以剔除。表達於少於3個細胞中的基因被排除。採用主成分分析（PCA）進行降維後，使用20個維度進行統一流形近似與投影（UMAP）可視化。
使用FindAllMarkers函數鑑定每個簇或細胞類型中的差異表達基因（DEGs）。樣本間的DEGs採用FindMarkers函數並結合Wilcoxon秩和檢驗進行鑑定，要求最小上調幅度為0.1 log-fold，校正後p值閾值為0.01。計算了每個樣本中各細胞類型的平均表達值。這些步驟是在生物資訊學專家協作下完成的。
對於公開可獲得的人類囊胚數據集的整合
使用Monarch® Total RNA Miniprep Kit提取總RNA。
進行了質量控制，以確保總RNA樣本滿足以下標準：總量≥400 ng、體積≥20 µl、濃度≥20 ng/µl，RNA完整性數值（RNA Integrity Number, RIN）≥6.8（Agilent 2100™ Bioanalyzer），純度（OD260/280和OD260/230）≥2.0（NanoDrop™ ND-1000 Spectrophotometer，Thermo Scientific，RRID:SCR_016517）。
對於bulk RNA-seq，每個樣本由Novogene完成測序，測序深度為40M PE150 reads。使用STAR在預設參數下將reads比對至ponAbe3基因組。基因的GTF註釋文件從UCSC genome browser下載。使用Cufflinks（v2.2.1）基於比對後的BAM文件和GTF註釋文件進行基因組裝與定量，生成每千鹼基轉錄本每百萬比對reads片段數（FPKM）表。使用Htseq（v.0.12.4）計算轉錄本計數。
對於具有重複的樣本，採用DESeq2進行差異基因分析，p值截斷為0.05，倍數變化截斷為1.5。對於無重複的樣本，採用EdgeR進行差異基因分析，p值截斷為0.05。這些步驟是在生物資訊學專家協作下完成的。
對在至少10%樣本中具有至少5條比對reads的RNA-seq計數進行了主成分分析（PCA）。使用Bioconductor包sva（v.3.34.0）中的ComBat函數校正批次效應。PCA分析使用FactoMineR R包完成。在採用hclust函數進行層次聚類後，繪製了聚類樹狀圖。
實驗未進行隨機化，在實驗過程中及結果評估期間，研究人員未對分組分配實行盲法。除非另有說明，所呈現的數據和統計分析均使用 GraphPad Prism 進行繪圖和分析。對於 qPCR，兩個基因之間的相對標準化基因表達數據採用雙樣本 t 檢驗進行比較，使用雙側 p 值閾值 0.05，並採用 Levene 方差齊性檢驗，p 值閾值為 0.05；兩個以上基因之間的相對標準化基因表達數據採用單因素方差分析，p 值閾值為 0.05，隨後進行 Tukey 事後多重比較檢驗，p 值閾值為 0.05。
對於效率、形態學和 ELISA 數據，採用 Shapiro-Wilk 正態性檢驗，p 值閾值為 0.05；符合正態分佈的數據採用單因素方差分析進行比較，p 值閾值為 0.05，隨後進行 Tukey 事後多重比較檢驗，p 值閾值為 0.05；不符合正態分佈的數據則採用 Mann-Whitney 檢驗或 Kruskal-Wallis 檢驗進行比較，p 值閾值為 0.05，隨後進行 Dunn 事後多重比較檢驗，p 值閾值為 0.05；均值與參考均值之間的比較採用單樣本雙側 t 檢驗，p 值閾值為 0.05。
作者聲明不存在競爭性利益。
補充圖 1、補充圖 2、補充圖 3、補充圖 4、補充圖 5、補充圖 6、補充圖 7、補充表
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© Research Square 2026 | ISSN 2693-5015（在線）
📄 原文連結：https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-8154543/v1
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