RBM47是小鼠胚胎幹細胞分化的關鍵調控因子
Pavan Kumar Mysuru Shivalingappa、Divya Kumari Singh、Vaishali Sharma及另外3位作者
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https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1452998/v1
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RNA結合蛋白（RBP）對於調控基因表達至關重要，因為它們參與RNA代謝的每一個步驟。多種RBP對哺乳動物的正常生長和發育是必需的。RNA結合基序47（RBM47）是一種含有RRM結構域的RBP，其在哺乳動物胚胎發育中的作用尚不清楚，但被認為是必需的，因為其在小鼠胚胎中的缺失會導致圍生期致死。在本研究中，我們試圖闡明RBM47在小鼠胚胎幹細胞（mESC）命運決定中的重要性。下調
哺乳動物胚胎發生始於形成一個全能性的單細胞合子，隨後進入一系列複雜事件，其中包括多種細胞類型的建立、細胞間相互作用，以及指導組織和器官模式形成以生成完整個體的機械和化學信號[
RNA結合基序47（RBM47）是一種新型的、脊椎動物中保守的RBP，含有三個RNA識別基序（RRM），在RNA編輯、早期胚胎發育和癌症中發揮多方面作用[
AB 2.2 mESC細胞系由英國Hinxton的Wellcome Sanger研究所惠贈。小鼠ESC在無飼養層條件下培養，使用0.2%明膠作為貼壁因子，培養於無血清ESC培養基中：knockout DMEM，補充15% KOSR、1×非必需氨基酸、1×GlutaMAX、0.1 mM
用於製備慢病毒的質粒如下：pLKO.1-TRC克隆載體由David Root提供（RRID:Addgene_10878）；psPAX2包裝質粒和pMD2.G包膜編碼質粒由Didier Trono提供（RRID: Addgene_12260和Addgene_12259，分別對應）。pLKO.1-TRC質粒經以下方式酶切
慢病毒在培養於補充10% FBS的DMEM/F12中的HEK 293T細胞中製備。這些細胞使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）進行逆向轉染，導入慢病毒質粒。DNA混合液的製備方法為：將2.5 µg pLKO.1-shRNA質粒、2 µg psPAX2和1 µg pMD2.G加入Opti-MEM（Gibco）或任一無血清基礎培養基中稀釋至總體積243 µL，隨後加入7 µL P3000試劑。
脂質混合液則在另一管中製備：將7 µL Lipofectamine 3000試劑加入243 µL Opti-MEM中稀釋。通過將DNA混合液逐滴加入脂質混合液中獲得DNA-脂質複合物。用移液器輕輕混勻後，在超淨台內孵育10分鐘。與此同時，HEK 293T細胞經胰蛋白酶消化、收集，並重懸於完全培養基中。將DNA-脂質複合物與5–6 × 10
小鼠ESC在鋪板時於6孔板中進行轉導，使用不同劑量的病毒濃縮液，懸浮於含有6 µg/mL polybrene的ESC培養基中，並孵育16–24 h。隨後用新鮮培養基更換培養液，並繼續培養1天。之後，使用含有1 µg/mL嘌呤黴素的培養基進行篩選，直至模擬轉導細胞（無病毒）完全死亡。MOI按照先前所述方法，通過計數病毒轉導細胞和對照細胞（無病毒/無嘌呤黴素）來確定[
按照生產商說明書，加入適量TRIzol Reagent（貨號：15596-018；Ambion，Life Technologies）從所有細胞類型中分離總RNA。分離得到的總RNA使用DeNovix分光光度計進行定量。取總RNA（0.5–1.0 µg）使用Verso cDNA synthesis kit（Thermo Scientific）反轉錄為cDNA。
RT-qPCR按每個樣本重複2次或3次進行，總反應體積為10 µL，其中包含2.5 µL按1:25稀釋的cDNA模板、0.4 µM的正向和反向引物，以及PowerUp SYBR green master mix（Applied Biosystems，A25743），並在QuantStudio 6 Flex（Thermo Scientific）上運行。採用四階段熱循環程序（快速循環模式）。簡言之，階段I（保持）– 50℃ 2 min
小鼠ESC接種於包被0.2%明膠的96孔光學底板（Nunc 165305）中。棄去舊培養基後，用PBS清洗細胞。細胞在室溫下用4%磷酸鹽緩衝甲醛固定15分鐘，並用PBS清洗3次。隨後將細胞置於含5% BSA + 0.2% Triton-X的PBS中，進行30分鐘的透化和封閉。細胞與用抗體稀釋液（含1% BSA + 0.05% Triton-X的PBS）稀釋的一抗（補充表3）在室溫下孵育1小時。
用PBS清洗3次以去除多餘抗體後，細胞與用抗體稀釋液稀釋的相應熒光團偶聯二抗孵育，再用PBS清洗3次，並使用含有DAPI和抗淬滅劑DABCO（Sigma）的封片劑進行細胞核染色。樣品在Thermo Scientific CellInsight CX7 LZR高內涵分析（HCA）平台上，採用寬場或共聚焦應用進行成像。圖像隨後使用ImageJ軟件進一步處理。
穩定表達任一sh的小鼠ESC的體內分化潛能
定期監測小鼠畸胎瘤形成情況，並於4–5周時實施安樂死以收集畸胎瘤。使用遊標卡尺記錄畸胎瘤尺寸，橢球體體積按V = ½（長度×寬度
對於與細胞培養相關的實驗，生物學重複表示在不同時間從不同培養皿/孔中收集的樣本。採用 GraphPad Prism 8.2.1 (441) 進行作圖和統計分析。兩組之間差異的比較採用 Student’s t 檢驗，三組或三組以上的比較採用單因素方差分析（one-way ANOVA）並進行事後檢驗。關於所使用統計檢驗、重複次數及精確度測量的相關資訊，均在各圖例中註明。
統計學顯著性定義如下：無顯著性（ns）p > 0.05，* p
小鼠早期發育涉及在囊胚階段三種譜系的確定。如圖所示。
我們採用 RNAi 方法進行功能缺失研究，以探究……的重要性。
已有充分文獻表明，在小鼠囊胚 E4.5 階段，FGF4-ERK 信號通路是內細胞團（ICM）向 NANOG 陽性的上胚層（Epi）和 GATA6 陽性的原始內胚層（PrE）進行細胞命運決定的核心通路（圖）。
RBM47 是一種在脊椎動物中保守的多功能 RNA 結合蛋白，已有研究提示其對發育、C 到 U 的 RNA 編輯以及腫瘤抑制至關重要[
本研究採用小鼠胚胎幹細胞（ESC）及譜系特異性分化方法作為
我們的研究利用小鼠 ESC 有效重現了 RBM47 在早期哺乳動物發育中的重要性。我們證明了其在 ESC 向神經外胚層和內胚層譜系分化中的關鍵作用。此外，還需要開展體內研究，以全面理解由……所誘導的胎兒吸收和圍產期致死的潛在異常機制。
概念構思：SAB、AS 和 PKMS；經費取得：AS；監督指導：SAB 和 AS；方法學：SAB、AS 和 PKMS；研究實施與正式分析：PKMS（ES 細胞培養與實驗、RNA 分離、RT-qPCR、Western blot、免疫染色、分子克隆），DKS（RNA 分離、RT-qPCR、細胞週期與 Western blot），VS（RNA 分離與 RT-qPCR）以及 VA（RT-qPCR 與質粒篩選）；撰寫—初稿準備：PKMS 和 SAB；撰寫—審閱與編輯：SAB、PKMS。
所有作者均對論文的前期版本提出了意見，並閱讀和批准了最終稿。
本研究得到印度政府生物技術部（BT/PR15178/MED/31/313/2015）以及國家細胞科學中心（NCCS）院內經費的資助。青年和高級研究獎學金資助情況如下：PKMS 由大學教育資助委員會資助；DKS 由生物技術部資助；VS 由印度醫學研究理事會資助。VA 由項目資助 BT/PR 10708 支援。
論文及其補充資訊文件包含了本研究期間產生的所有相關數據。
我們將本研究論文獻給我們已故同事安賈利·希拉斯博士（Dr. Anjali Shiras），以紀念她不幸因 COVID-19 離世。我們衷心感謝艾倫·布拉德利教授（Prof. Alan Bradley）和 Wellcome Sanger Institute 提供 AB2.2 小鼠胚胎幹細胞（ESCs）。我們感謝阿卡拉姆·巴加爾博士（Dr. Akaram Bagal）對畸胎瘤切片提出的意見。我們感謝 NCCS 的所有中心平台及其工作人員在研究過程中給予的支援。
作者在本文討論的任何材料中均不具有經濟利益或專有權益。
關於多能幹細胞（ESCs/iPSCs）的實驗符合《國家幹細胞研究指南》（2013 年和 2017 年），並已獲得 NCCS 幹細胞研究機構委員會的倫理批准（編號：NCCS/IC-SCR/2016-I/3）。動物實驗按照 CPCSEA 指南開展，並已獲得研究所動物倫理委員會的倫理批准（編號：EAF/2015/B-253 和 EAF/2019/B-351）。本研究中使用的重組 DNA 技術符合生物技術部的生物安全指南，並已獲得機構生物安全委員會的倫理批准（編號：2015033 和 2018111）。
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© Research Square 2026 | ISSN 2693-5015（網絡版）
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