人類胚胎形態塑造始於緻密化，在此過程中，細胞彼此緊密接觸並形成更為緻密的結構
包括哺乳動物在內的模式生物的力學表徵，極大地推動了我們對動物形態發生的理解
人類形態發生始於第4天的緻密化
在緻密化過程中，細胞最大化其細胞—細胞接觸面積，並最小化其暴露於外部培養介質的表面積
(a) 張力測繪方法示意圖。使用半徑為
由於單個胚胎內卵裂球的卵裂分裂可能彼此相差數小時發生，緻密化發生時相鄰細胞可處於不同的卵裂階段（
在小鼠胚胎中，張力的增加
(a) 人類胚胎緻密化前（上）和緻密化後（下）的免疫染色代表性圖像，其中MYH10為綠色，F-肌動蛋白為紅色，CDH1為藍色。比例尺，20
為檢驗收縮性是否負責產生驅動人類胚胎緻密化的張力，我們對已緻密化胚胎使用了肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑ML7。ML7使胚胎發生去緻密化，接觸角在數分鐘內下降了27 ± 2°（來自6個胚胎的平均值 ± SEM，配對Student’s t檢驗，p < 10
儘管在緻密化過程中缺乏明顯的分子重組（
綜上，我們發現，儘管細胞收縮性和細胞—細胞黏附二者對於人類胚胎的緻密化都是必需的（
有趣的是，收縮性和黏附的喪失會導致不同的力學特徵（
為確定緻密化缺陷的力學起源，我們測量了自發性緻密化失敗胚胎的張力。我們將當沒有任何接觸角增大到131°以上時判定為緻密化失敗，該閾值是基於7個正在緻密化和7個未緻密化胚胎的統計結果確定的
(a) 緻密化失敗胚胎的代表性圖像，其中在第3
後超過30小時內，沒有任何細胞接觸達到131°
另一種常見的緻密化缺陷是部分緻密化，即部分卵裂球未參與緻密化細胞團塊的形成
為研究這一機制，我們測量了表現出部分緻密化的胚胎的張力（
綜上，利用人類著床前胚胎的力學特徵
J.F.、H.T.、C.P.和J.-L.M.提出項目構想並獲得經費資助。J.F.和J.-L.M.設計實驗。J.F.實施實驗。J.F.和J.-L.M.分析數據。J.F.、D.N.D.、V.B.L和C.P.組織胚胎採集。N.E.和H.T.撰寫理論部分並進行數值模擬。J.-L.M.在J.F.、N.E.、H.T.和C.P.的意見基礎上撰寫論文。
本項目所使用的人類捐贈胚胎經法國生物醫學署（Agence de la Biomédecine，ABM，批准編號RE 17-011R）批准，且符合國際幹細胞研究學會指南。
捐贈胚胎在Fertilité Paris Centre ART Center（Biologie de la reproduction-CECOS, Cochin, APHP.Centre-Université de Paris）、Clinique La Muette（法國巴黎）或Clinique Pierre Chérest（法國Neuilly sur Seine）進行冷凍保存和儲存。隨後，胚胎被轉運至Institut Curie，並立即復甦用於本研究項目。
本研究共使用了由33對患者夫婦提供的43枚胚胎。胚胎於第2天（n = 24）或第3天（n = 19）採用慢速冷凍程序（n = 30）或玻璃化冷凍（n = 13）進行冷凍。在冷凍時，第2天和第3天胚胎的平均細胞數分別為4 ± 1個細胞（平均值 ± 標準差，最少2個，最多8個）和8 ± 1個細胞（平均值 ± 標準差，最少6個，最多10個）。對於壓實全過程中的測量（
胚胎的冷凍保存時間為11.2 ± 4.9年（平均值 ± 標準差；慢速冷凍和玻璃化冷凍胚胎分別為13.6 ± 4.0年和5.7 ± 1.1年）。
供體的平均年齡分別為女性34.1 ± 3.5歲、男性36.3 ± 6.3歲（平均值 ± 標準差；33對夫婦中有30對提供了相關數據，另有3對數據目前缺失）。31/41枚胚胎由卵胞漿內單精子注射（ICSI）產生，10/41枚胚胎通過常規體外受精（IVF）獲得。所有精子均為新鮮精子。
胚胎在配備加熱板（Leica MATS-Type TL base，必要時設定為37°C）的體視顯微鏡（Leica M80）下，使用Stripper微量移液管（Origio）進行操作。
冷凍保存的胚胎按照生產商說明進行復蘇。慢速冷凍胚胎使用Embryo thawing packs（Origio）進行復蘇，玻璃化冷凍胚胎使用Vit Kit（Irvine Scientific）進行復蘇。完整存活率定義為復甦後立即觀察到無任何細胞裂解的胚胎百分比；在隨後納入實驗分析的胚胎中，該比例為88.6%（39/43）。所有胚胎在復溫過程中均存活，且至少有50%的細胞保持完整。
胚胎在配備加熱板（Leica MATS-Type TL base，設定為37°C）的體視顯微鏡（Leica M80）下，使用Stripper微量移液管（Origio）進行操作。胚胎被置於預平衡的培養條件中（至少在37°C、5% O
在表面張力測量之前，胚胎從其
ML7（Sigma-Aldrich, I2764）以50% EtOH稀釋至10 mM。第4天壓實胚胎首先置於含1:2000 EtOH的培養基中15 min，隨後進行額外30 min的表面張力測量。之後將胚胎轉移至含10 μM ML7的培養基中15 min，再進行30 min的表面張力測量。隨後將胚胎重新置回常規培養基CSCM-C中恢復培養。6/6枚胚胎均重新壓實，且5/6枚胚胎形成了囊胚。
同樣地，第4天壓實胚胎被置於Embryo Biopsie Medium（Irvine Scientific）中，這是一種不含Ca的商業培養基
胚胎在37°C下用2% PFA（Euromedex，2000-C）固定10 min，隨後在PBS中清洗，並在室溫下於PBS中的0.01% Triton X-100（Euromedex，T8787）（PBT）中進行透化處理，之後置於封閉液（含3% BSA的PBT）中，於4°C封閉至少4 h。一級抗體於4°C下在封閉液中孵育過夜。經室溫PBT清洗後，胚胎於室溫下與二級抗體、DAPI和鬼筆環肽共同孵育1 h。隨後將胚胎在PBT中清洗，並立即在礦物油覆蓋下置於含BSA的PBS中進行成像。
為製備微吸管，採用P-97 Flaming Brown拉針儀（Sutter Instrument）對玻璃毛細管（World Precision Instruments，TW100-3）進行拉制，參數設置如下：Ramp +3–5，Pull 55，Velocity 50，Time 50，Pressure 500。
使用微鍛針儀（Narishige，MF-900）將針切割形成半徑為12–22 μm的鈍性開口，並在距針尖80–100 μm處以20°角進行彎折。
微吸管通過夾持頭和毛細管固定器（Eppendorf，920007392和9200077414）安裝於微操縱器（Leica AM6000）上。微吸管連接至一個充滿PBS的中間儲液槽，通過50 mm微尺度平移台（Newport）控制其高度，以產生正壓和負壓。
為測量細胞表面張力，在較低吸持壓力（20–30 Pa）下，使微吸管與胚胎中一個卵裂球的自由表面接觸。
在測量胚胎中兩個相鄰細胞的表面張力後，我們假定在測量時間尺度上系統處於穩態，並根據細胞-細胞接觸處的力平衡方程計算界面張力。
表面張力測量在Leica DMI6000 B倒置顯微鏡上進行，配備40x/0.8 DRY HC PL APO Ph2（11506383）物鏡。Retina R3相機前安裝有一枚0.7x鏡頭。顯微鏡配有定製孵育腔（EMBLEM），用於將樣品保持在37°C並維持5% CO₂氣氛。
對於延時成像，胚胎在復甦後置於CellDiscoverer 7（Zeiss）的腔室內，在37°C、5% O₂加濕條件下進行培養和成像。
免疫染色樣品使用配備CSU-X1轉盤共聚焦單元（Yokogawa）的Zeiss Observer Z1顯微鏡進行成像，採用405、488、561和642 nm激光線，通過63x/1.2 C Apo Korr水浸物鏡；發射信號經450/50 nm、525/50 nm、595/50帶通或610 nm低通濾光片收集，並由ORCA-Flash 4.0相機（C11440，Hamamatsu）記錄。
移液管尺寸、細胞曲率半徑和接觸角分別使用Fiji中的直線、圓和角度工具進行測量。
為測量皮質熒光強度，採用先前所述的方法。
均值、標準差、SEM和Pearson相關係數使用Excel（Microsoft）計算。統計學檢驗使用免費在線工具BiostaTGV進行。
接觸角閾值使用Cutoff Finder確定。
非緊實化胚胎和完全緊實化胚胎根據 ESHRE 指南進行了定性評估。
樣本量並非預先確定，而只是實驗重複的結果。沒有排除任何樣本。未使用隨機化方法。研究人員在實驗過程中未實行盲法。
用於分析的圖像和數據將上傳至公共數據庫。
完全緊實化、非緊實化和部分緊實化胚胎的卵裂球階段通過追蹤連續細胞分裂直至最後一次張力測量來確定（分別為 7、6 和 6 個胚胎，以及 40、32 和 33 個卵裂球）。對於部分緊實化胚胎，緊實化卵裂球、與被排除細胞相鄰的緊實化卵裂球以及被排除細胞的階段分別單獨標示（分別為 13、10 和 10 個）。
最後一次觀察到的 3 之後時間的均值、均值標準誤（SEM）以及細胞和胚胎數量
外部接觸角 θ 的均值、均值標準誤（SEM）以及細胞和胚胎數量
最後一次觀察到的 3 之後時間的均值、均值標準誤（SEM）以及細胞和胚胎數量
最後一次觀察到的 3 之後時間的均值、均值標準誤（SEM）以及細胞和胚胎數量
在我們的研究中，我們假設著床前人類胚胎中卵裂球的形狀主要受皮質張力控制，這與其他早期胚胎中的情況類似（
對於一個細胞雙聯體，我們在下文回顧（中提出的一些結果
細胞—細胞連接處的 Young-Dupré 定律：
其與體積約束共同決定雙聯體的幾何形狀
（左）細胞雙聯體的示意圖，顯示細胞—培養基界面和接觸界面的表面張力
Young-Dupré 定律可重寫為內外接觸角的函數
需要注意的是，上述力平衡方程並不限於細胞雙聯體，而是適用於細胞之間任何接觸和連接處。因此，下文我們將其直接應用於人類胚胎。
在對稱雙聯體或對稱細胞—細胞接觸的情況下，即當
該問題可重新表述為一個幾何問題，其中我們尋求點之間的最小距離
在人類胚胎中，緊實化參數
相比之下，在小鼠中，通過增加時，緊實化參數 α 從 0.72 降至 0.28
從圖形上看，這些最短路徑可以繪製在雙對數座標的相圖上。為了便於比較小鼠和人類情況，我們在下圖中將所有張力都按其初始值進行了歸一化
歸一化張力相圖（雙對數座標），比較了人類和小鼠胚胎緊實化過程的實驗演化（分別以黑色和白色實線表示）與使張力變化最小的對應演化路徑（虛線）。緊實化狀態
該圖表明，在這樣的相圖中，小鼠和人類胚胎都遠離最小壓實路徑，但小鼠胚胎在最小化其張力變化以達到最終壓實狀態方面表現更優。
通過令拉格朗日函數關於雙細胞體形狀幾何和拉格朗日乘子的導數為零，可得到最優性條件（
將上述細胞雙體的方法加以推廣，我們的數值模擬包括對定義在初始非流形三角網格上的表面能進行約束優化。對於一組的表面能和拉格朗日函數
由拉格朗日函數可以計算出力
界面面積和細胞體積可以很容易地表示為三角形上的求和
它們關於頂點位置的導數
在機械平衡時，所有界面都遵循拉普拉斯定律，並且每個連接處都滿足楊-迪普雷方程。這些方程也可以等價地表示為表面能的約束優化
這導出了一個關於的線性方程組
為了找到機械平衡，需要求解方程
在每次迭代中，按照上述投影方法重新計算細胞壓力。
約束優化方法被應用於非流形多材料網格，遵循（
對於壓實，相關對照實驗已在（
一種情況是胚胎完全壓實，其細胞-培養基表面張力的初始值和最終值為
另一種情況是該胚胎中的一個細胞具有其細胞-培養基張力
排除細胞與壓實細胞之間接觸角隨接觸張力數值變化的圖
為了獲得細胞形狀的平滑演化，張力值在總計15個點上從初始值到最終值進行線性插值。模擬中使用的初始和最終張力值相較於實驗值縮小了1000倍，並在圖中以向右箭頭分隔
模擬中使用的張力值。單位對應於1000 pN/
我們感謝居里研究所遺傳學與發育生物學單元的成像平台（PICT-IBiSA@BDD），該平台是法國國家研究基礎設施 France-BioImaging（ANR-10-INBS-04）的成員，感謝其提供的卓越支援。我們感謝 Nadia Kazdar、Lucie Delaroche、Anne Le Dû，以及來自 La Muette 診所（法國巴黎）、Pierre Chérest 診所（法國納伊-敍爾-塞納）和 Cochin 醫院（法國巴黎）的 ART 團隊全體成員對人類胚胎實驗的支援。
我們感謝 Maître 實驗室全體成員、Y. Bellaïche 和 M.-H. Verlhac 的討論與意見。我們感謝 M.-H. Verlhac 在整個項目期間對行政事務的支援。我們由衷感謝將其剩餘胚胎捐贈用於科研的患者。
本項目由巴黎文理研究大學（Paris Sciences et Lettres, PSL）QLife（ANR-17-CONV-0005）資助，受資助者為 J.-L.M.、C.P. 和 H.T.；同時還獲得法國國家健康與醫學研究院（INSERM）橫向項目“人類發育細胞圖譜”（Human Development Cell Atlas, HuDeCA）對 J.-L.M. 和 C.P. 的資助。
J.-L.M. 實驗室的研究得到居里研究所（Institut Curie）、法國國家科學研究中心（Centre National de la Recherche Scientifique, CNRS）和法國國家健康與醫學研究院（Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, INSERM）的支援，並獲得以下項目資助：Schlumberger 教育與研究基金會（Fondation Schlumberger pour l’Éducation et la Recherche）經由法國醫學研究基金會（Fondation pour la Recherche Médicale）提供的資助、歐洲分子生物學組織青年研究員計劃（European Molecular Biology Organization Young Investigator Program, EMBO YIP），以及 Labex DEEP（ANR-11-LABX-0044，屬 IDEX PSL ANR-10-IDEX-0001–02 的一部分）。
J.F. 獲得法國醫學研究基金會獎學金資助（FDM202006011290）。H.T. 和 N.E. 開展的工作得到法國國家科學研究中心（CNRS）和法蘭西公學院（Collège de France）的支援。本項目未使用歐洲研究委員會的任何資助經費。
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📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.01.09.475429
🏷️ 人類胚胎 緻密化 形態發生 細胞力學 細胞黏附 肌球蛋白收縮性