詳細的蛋白質組圖譜對於理解分子通路和蛋白質功能至關重要。儘管樣品製備、儀器設備和數據分析方面已取得顯著進展，單細胞蛋白質組學目前仍受限於蛋白質組覆蓋深度和定量性能。我們將一根具有零死體積末端的高通量色譜柱與以DIA模式運行的 Thermo Scientific™ Orbitrap™ Astral™ 質譜儀相結合。我們證明了該方法在超低輸入量條件下實現了前所未有的蛋白質組覆蓋深度，以及定量的準確性和精密性。
通過使用定製譜庫，我們在每天50個樣本（SPD）的通量下，僅用250 pg HeLa樣品即可鑑定多達7400個蛋白質組。我們對多種數據分析策略進行了基準比較，評估了其對FDR的影響，並表明蛋白質水平的FDR可以較容易地維持在1%。利用雙蛋白質組混合樣品，我們檢驗了定量的最佳參數，並表明即使在單細胞水平輸入量下，仍可成功檢測出2倍的倍數變化差異。
最終，我們將該工作流程應用於A549細胞，在單個細胞中獲得了多達5300個蛋白質組的覆蓋度，從而能夠觀察細胞群體中的異質性，並研究細胞大小與細胞週期階段之間的依賴關係。此外，我們的工作流程還使我們能夠區分
基於質譜的單細胞蛋白質組學（SCP）已發展成為一種強有力的技術，能夠以不斷提升的覆蓋度和通量研究細胞異質性。為應對超低輸入量這一挑戰，多個實驗室開發了大量微型化和自動化的樣品製備工作流程。
Thermo Scientific™ Orbitrap™ Astral™ 質譜儀的近期引入
在這裏，我們研究了 Orbitrap Astral 質譜儀與 Aurora™ Ultimate TS 25 cm 納升級超高效液相色譜（UHPLC）柱聯用時的性能；該色譜柱配備了完全集成的離子源接口，以儘量減少峰展寬並獲得儘可能高的信號強度。我們優化了梯度長度，以實現最大的蛋白質組覆蓋度，並評估了定量的準確性和精密性。
得益於上述方法學改進所產生的協同效應，單細胞蛋白質組學如今進入了一個新階段，成為生物學家用於補充單細胞基因組學數據的重要工具。
我們將 Orbitrap Astral MS 與 Thermo Scientific™ FAIMS Pro 接口以及 Auroa Ultimate 25 cm TS 色譜柱（集成噴射尖端且零死體積）相結合，旨在最大限度提高超低輸入蛋白質組樣本的靈敏度。為了獲得一個在評估與基準測試中可代表單細胞相當輸入量的標準樣品，我們決定分別進樣 250 pg 商業化 HeLa 和 K562 肽段。
將總體酶解產物稀釋於含有 0.015% N-十二烷基-β-D-麥芽糖苷（DDM）的 0.1% TFA 中，以改善肽段溶解性、重複性和定量準確性。
基於我們的結果，我們推測較短的梯度更有利於超低輸入樣本，因為其可產生更尖鋭、因而峰強更高的色譜洗脱峰。一旦在 50 SPD 達到最大值，更快的梯度可能會因分離能力不足和譜圖複雜性增加而受到影響，從而不利於鑑定數量。具有極窄洗脱峰的快速梯度還會進一步減少每個峰的數據點數（
接下來，我們利用同一批 HeLa 和 K562 酶解產物中的 10 ng 樣品構建了一個定製文庫，以進一步提高蛋白質組覆蓋度。這些文庫同樣以 DIA 模式採集，並在文庫中鑑定出超過 62,000 個前體離子（
為估算真實的錯誤發現率，我們通過打亂目標數據庫中所有序列，同時保持所有蛋白酶切割位點（P、K 和 R）的位置不變，構建了一個打亂的目標數據庫。在後續檢索中，這兩個數據庫均作為目標數據庫使用。它們共享的肽段少於 0.01%，且規模相近，從而能夠對 FDR 進行公平估計，同時在打亂的目標數據庫中發現代表真實陽性命中的肽段的風險極低（
分別進樣了來自稀釋總體酶解產物的 250 pg 或 10 ng HeLa 肽段，這與圖中所示結果一致
在考察圖中所示的 HeLa 數據時
然而，通過彙總 3 次重複實驗中的所有唯一鑑定結果來報告總 ID 數（補充圖 1），若不額外進行 FDR 過濾步驟，會累積錯誤鑑定的前體離子和蛋白質。這將導致 FDR 升高，最高可達 2.7%（補充圖 2）。因此，作者建議報告平均 ID 數，而非總 ID 數。
為了獲得儘可能高的靈敏度，我們使用 FAIMS Pro 接口篩選了最佳補償電壓。根據既往經驗，-48 V 在所用設備上可獲得最佳結果，因此該電壓被用於所有其他運行。以 10 V 為步長在 –38 至 –88 V 範圍內篩選補償電壓表明，最佳設置位於 -48 至 -68 V 之間；與其他任何設置相比，-58 V 下檢測到的蛋白質組數略多，且前體離子數明顯更多。儘管使用 FAIMS Pro 接口存在損失部分離子的風險，但由於其可改善信噪比並提升動態範圍，因此使用該接口似乎仍然具有優勢。
根據我們的實驗結果，在最佳設置下使用 FAIMS Pro 接口可顯著提高信噪比（補充圖 9），與未使用 FAIMS 接口的測量相比，最多可多鑑定 42.6% 的前體離子和 55.3% 的蛋白質組。
每次進樣均為來自稀釋整體酶解樣品的 250 pg HeLa 肽段。肽段以 50 SPD 的通量進行分離。在連接或不連接 FAIMS Pro 接口單元以及給定補償電壓的條件下記錄數據。
隨後，我們評估了該工作流程在單細胞水平輸入下的定量性能，並在相似設置、相同輸入量和相同梯度長度條件下，將數據與我們的 Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 480 質譜儀進行基準比較。
儘管變異係數能夠合理估計技術重複之間的定量精密度，我們還進一步利用雙蛋白質組混合物評估了定量蛋白質的準確性和精密度。
每次進樣均為來自稀釋整體酶解樣品的 250 pg 雙蛋白質組混合物，其組成分別為 150 pg HeLa + 100 pg 酵母或 200 pg HeLa + 50 pg 酵母。肽段以 50 SPD 的通量進行分離。數據以 DIA 模式採集，對 Orbitrap Astral MS 和 Orbitrap Exploris 480 MS 分別採用各自優化但不完全相同的設置（見方法部分），並使用 Spectronaut 18 中的 direct DIA+ 在 1% FDR 下進行分析。
定量在 MS1 水平上完成。Bland–Altman 圖（下方）中的點表示在兩種蛋白質組混合物中具有給定 log2 平均丰度和豐度 log2 倍數變化的蛋白質。密度圖（右側）描繪了測得的 log2 倍數變化分佈，CV 圖（上方）顯示了在整個丰度範圍內採用滾動窗口對 100 個蛋白質進行定量所得的局部 CV，n=3。
我們的結果表明，與 Orbitrap Exploris 480 MS 相比，Orbitrap Astral MS 可定量的蛋白質數量超過其兩倍，這很可能歸因於其更高的速度和靈敏度。當篩選兩種儀器中共同檢測到的蛋白質時，
進一步增加一個過濾條件以排除僅基於單條肽段定量的蛋白質，不會影響準確性，但可進一步提高定量精密度，且這一現象與所使用的儀器無關（補充圖 4）。作為代價，可定量蛋白質的數量減少了 17%（Orbitrap Astral MS）至 28%（Orbitrap Exploris 480 MS）。我們還通過在酵母含量上設置更大的 5:1 和 10:1 倍數變化研究了準確性和精密度（補充圖 5），結果顯示出與上述相似的趨勢。
我們認為，這些數據也為未來的生物學應用提供了有價值的參考，尤其是那些旨在評估單細胞蛋白質組學中能夠被可靠識別所需的最小倍數變化調控幅度的研究。
為了確定使用 cellenONE 機器人進行無標記樣品製備的最優策略，我們對該平台上已建立的一些方案進行了基準測試。我們決定採用本課題組此前發表的 one-pot 384 孔樣品製備方法。
在我們的首次嘗試中，proteoCHIP LF48 相較於 one-pot 384 孔工作流程表現出明顯更優的性能，鑑定到的蛋白質組數量多出 48%。然而，在使用 LF48 芯片鑑定到的 1979 個蛋白質組中，有 693 個（35%）也在空白對照中被鑑定到；該空白對照包含所有試劑，並接受了與單細胞樣本相同的處理，但未加入細胞（補充圖 3A）。為降低背景信號，我們對特氟龍材質的 LF48 芯片實施了嚴格的清洗流程。
結果顯示，空白對照的背景水平降低至與 384 孔板相當的水平，但鑑定數量也下降至 1128 個蛋白質組，略低於我們使用 384 孔板獲得的結果（1341 個蛋白質組）。我們推測，污染肽覆蓋在（未經嚴格清洗的）重複使用 LF48 芯片的表面，並充當了載體，但同時也可能掩蓋了真實的（受調控的）蛋白質。
隨後，我們將較新的 EVO96 芯片原型（由聚丙烯製成，經過多次使用和清洗）與 one-pot 384 孔方案進行了比較，結果表明，即使在 384 孔板具有更低背景的情況下，384 孔板仍獲得了更多的蛋白質組鑑定。僅選擇較大的（>20 μm）A549 細胞時，使用 one-pot 384 孔工作流程平均可鑑定 3690 個蛋白質組，而使用 EVO96 芯片並進行一次樣本轉移至 96 孔低吸附板時，僅可鑑定 2348 個蛋白質組（補充圖 3B）。
我們得出結論，在我們的實驗條件下，one-pot 384 工作流程似乎最適合用於樣本製備，因為其鑑定數量具有競爭力，甚至更優，且操作更為簡便，無需轉移步驟，也無需去除十六烷。此外，我們認為報告空白對照對於檢查背景污染具有很高的重要性，尤其是在芯片材料重複使用的情況下，這一問題更為突出。因此，本研究中的所有單細胞樣本均採用 one-pot 384 孔方法進行製備。
A549 是一種人非小細胞肺癌細胞系，常用於基礎研究和藥物發現。我們決定使用該細胞系對我們的工作流程進行原理驗證研究。利用 cellenONE 機器人採集了三種不同大小組別的細胞，其直徑範圍為 15–30 μm。使用 Orbitrap Astral 質譜儀對 66 個 A549 單細胞和 3 個空白樣本進行了測定。正如預期，鑑定到的蛋白質組數量與細胞大小相關（
通過 FACS 將單個細胞分選至 384 孔板中。消化後的細胞以 50 SPD 進行分析，液相色譜和質譜參數採用先前在 Orbitrap Astral 質譜儀上優化得到的設置。
隨後，我們考察了這些培養且未經處理的 A549 細胞的細胞異質性程度，並通過主成分分析（PCA）發現，細胞根據其直徑呈現出不同的聚類模式（
需要注意的是，本研究未進行細胞週期控制，因此我們的細胞群體反映了處於各個週期階段的混合狀態，這妨礙了清晰分離，但仍然能夠成功研究該系統的異質性。
為進一步檢驗我們的分析型 LC-MS/MS 平台以及 SCP 的能力，我們分析了初始態 hPSC，並由其誘導產生 TE-like 細胞。在第 4 天收集 TE-like 細胞，並使用 FACS 分選 TROP2+ 細胞。我們評估了不同的分析策略（圖 8A）。採用基於文庫的方法，我們分別在 TE-like 細胞和初始態 hPSC 中鑑定出 2339 個和 2544 個蛋白質組。
為確認 SCP 能夠重現初始態 hPSC 與 TE-like 細胞之間已知的差異，我們對數據集中所有細胞進行了降維分析，採用線性 PCA 和非線性 UMAP 聚類分析。我們觀察到這兩類細胞群體在兩種方法下均表現出明顯分離（圖 8B、C），且與細胞類型一致。PCA 顯示解釋方差分別為 51.8%（PC1）和 4.9%（PC2）。
對 TE-like 細胞中上調蛋白進行的基因本體論（GO）分析顯示，以下生物過程顯著富集：細胞骨架組織（GO:0007010）、肌動蛋白細胞骨架組織（GO:0030036）、上皮細胞分化（GO:0030855）、上皮發育（GO:0060429）、細胞分化的正調控（GO:0045597）以及細胞分化（GO:0030154）；這些過程與先前描述的 hPSC 向 TE-like 細胞分化的基礎生物學過程相一致。
我們關於初始態 hPSC 和 TE-like 細胞的單細胞蛋白質組數據表明，單細胞蛋白質組學具備區分原代細胞並提取有意義生物學資訊的能力，這些資訊可對轉錄組數據的結果形成補充並加以豐富。
儘管在過去十年中，基於質譜的超低輸入蛋白質組學領域已經取得了巨大進展，但要同時實現高樣本通量、可重複性、定量準確性、精密度和高靈敏度，仍然極具挑戰性。本文提出的工作流程旨在通過以下組合滿足這些標準：採用高性能零死體積柱並配合短梯度分離，結合最先進、快速且高靈敏度的質譜儀之一，基於 FAIMS 的噪聲降低策略以及基於 DIA 的採集方式。所使用的填充床色譜柱在柱末端直接集成了拉制噴針發射器，從而最大程度地減少了峰展寬；同時，在樣品上樣過程中採用高流速，進一步提高了通量。
LC 流速在有效梯度期間被降低，以增強靈敏度。我們發現，總通量達到 50 SPD 是一個最佳平衡點，既能最大化樣品採集速度，又能保持足夠的測量時間，從而在每個洗脱峰上檢測到中位數為 5 個數據點，保證適當的定量分析。我們還發現，在使用 FAIMS Pro 接口時，最佳補償電壓還存在另一個“甜點區間”，即 -48 至 -58 V。在該條件下，噪聲得以降低，而那些在不使用 FAIMS 時也能被鑑定到的蛋白質，其序列覆蓋度並未受到負面影響。
與此同時，總體蛋白質組覆蓋度得到提升，因此，就我們的實驗結果而言，對於樣本量受限的樣品，使用 FAIMS 顯然具有優勢。
我們進一步發現，定製化譜庫以及經優化調整的隔離窗口大小，有助於最大化前體離子和蛋白質的鑑定數量。由此獲得了令人驚訝的高鑑定數：從僅 250 pg 的 HeLa 樣品中可鑑定接近 7,400 個蛋白質組，而從單個 A549 細胞中則可鑑定多達 5,200 個蛋白質組。允許進行匹配並未對 FDR 產生負面影響，並且使用 Spectronaut 18 的預設設置可確認其非常接近預期的 1%。
據作者所知，我們首次使用雙蛋白質組混合物在單細胞水平評估了定量準確性和精密度。我們發現，定量表現出乎意料地良好，並且在 Orbitrap Astral MS 以 50 SPD 運行時，每個洗脱峰獲得 5 個數據點似乎已足以成功區分蛋白質丰度的 2 倍變化。然而，樣本內已定量蛋白質的倍數變化的變異係數（CV）會隨着蛋白質丰度的降低而增加，在我們的蛋白質組混合物中，其範圍從較低的 5% 到最低丰度蛋白質的 40% 不等。
因此，單細胞樣本內的相對丰度也是未來生物學研究中的一個重要考量，因為目前對細胞群體進行可靠聚類只能依賴單細胞中丰度較高的蛋白質。儘管存在這一侷限性，Orbitrap Astral MS 在已定量蛋白質數量、靈敏度和定量準確性方面均明顯優於 Orbitrap Exploris 480 MS，從而能夠基於細胞大小和細胞週期階段研究未經處理的培養細胞的異質性，如在 A549 細胞中所示。
此外，我們觀察到的 TE 樣細胞與 naïve hPSC 細胞之間的明顯分離，突顯了該 SCP 工作流程在人體囊胚研究中的應用潛力。它有望顯著促進對 TE 發育機制、囊胚形態調控以及高質量囊胚分子標誌物鑑定的探索。最終，這些認識不僅有助於加深我們對人類囊胚發育的理解，還有可能提高 IVF 的成功率。
總之，我們確信，我們這一從樣本製備到數據解讀均經過優化和改進參數的綜合性工作流程，是推動單細胞蛋白質組學在靈敏度、重現性和定量性能方面邁向更高水平的一項極具價值的貢獻，並將有助於推動單細胞蛋白質組學領域從發展階段過渡為生物學家工具箱中的一種技術。
細胞在 37 °C、5% CO 的濕潤環境中培養
A549 和 HeLa 細胞的分離、裂解及消化在 384 孔板（Thermo Scientific™ Armadillo 45PCR Plate，384-well，#12657516）中使用 cellenONE® 機器人進行，具體方法如前所述。
為了將基於 proteoCHIP® 的樣品製備方法用於基準測試研究，細胞的分離與製備完全按照製造商手冊中的說明進行。芯片採用標準（非嚴格）清洗流程：在甲醇中超聲處理 20 分鐘，隨後用 Milli-Q 水充分沖洗，並於通風櫥中乾燥。由 Cellenion 建立了一套嚴格清洗方案，且被視為公司機密。
簡而言之，使用 cellenONE® 機器人將 300 nL 母混合液（0.2% DDM、10 ng/μL Trypsin Gold、100 mM TEAB）分配至 LF48 proteoCHIP® 或 EVO96 proteoCHIP®（Cellenion，法國里昂）的每個孔中。LF48 芯片預先在每孔中加入 2 μL 十六烷油（H6703-100ML，Sigma-Aldrich，德國達姆施塔特）。在細胞分離過程中，proteoCHIP 冷卻至 8°C，以使十六烷（LF48）凝固。
隨後按照上述方法分離細胞，並在 85% 相對濕度條件下逐步升溫至最終 50°C，以進行裂解和酶解。通過 cellenONE® 持續補加水分，使樣品保持水合狀態並維持近似恆定體積。
之後加入 3.5 μL 0.1% TFA，並將 proteoCHIP LF48 置於濕冰上冷卻，使十六烷再次凍結，從而可通過手動方式將其與含樣品的水相分離；隨後將樣品轉移至低吸附 96 孔 PCR 板（EP0030129512，twin.tec. PCR Plate 96 LoBind，帶裙邊，Eppendorf，達姆施塔特）的各個孔中。EVO96 proteoCHIP 不含十六烷，因此可直接置於 96 孔 PCR 板上方，通過離心（500 g，30 秒）轉移樣品。
Naive PSCs 在明膠包被的培養板上、以經 γ 射線照射處理的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）作為飼養層進行培養。包被及飼養層製備的具體方法與先前報道的方法一致。
採用 Accutase（Biozym，B423201）在 37°C 下消化 5 分鐘以解離 naive PSCs。隨後使用移液器進行溫和機械吹打解離，並經離心收集細胞沉澱。將沉澱重懸於 PXGL 培養基中，並補加 10 μM Y-27632（MedChemExpress，HY-10583）。為去除 MEFs，將細胞懸液轉移至明膠包被的培養板上，並於 37°C 孵育 70 分鐘。
採用 Countess 自動細胞計數儀（Thermo Fisher Scientific）結合台盼藍染色進行細胞計數和活力檢測。細胞以 1.2×10^5 個/孔的密度接種於 Geltrex（0.5 μl/cm^2）包被的 6 孔板中。培養在低氧培養箱中進行（5% CO2，5% O2）。在誘導第 0 天，將培養基更換為 PDA83 培養基，其組成為 N2B27 基礎培養基、1 μM PD0325901、1 μM A83-01（MedChemExpress，HY-10432）和 2% FBS。
第 1 天加入 2 μM XMU-MP-1。第 2 天和第 3 天，將培養基更換為含 2% FBS 的 N2B27。第 4 天，按照以下方案進行 FACS 分選。
TE樣細胞和初始態PSC分別在37°C下使用Accutase消化10分鐘和5分鐘。隨後使用移液器進行溫和機械解離。之後，細胞分別用針對TROP2和SUSD2的抗體進行染色。對於TE樣細胞分選，選擇TROP2+細胞並分選至384孔板中，以確保排除未分化細胞。同樣地，對於初始態hPSC分選，將SUSD2+細胞分選至384孔板中，以排除MEF。在這兩種條件下，均使用DAPI染色識別並排除死細胞。
HeLa（H）（Thermo Scientific，Pierce™ HeLa Protein Digest Standard，88328）和酵母（Y）（Promega，MS Compatible Yeast Protein Extract，Digest，Saccharomyces cerevisiae，100ug，V7461）在0.1% TFA中按以下比例混合，終濃度為250 pg/μL：H:Y = 200 pg : 50 pg；240 pg : 10 pg；150 pg : 100 pg。
取每種雙蛋白質組混合物1 μL（=250 pg）進樣，以評估超低輸入水平下的定量下限。
HeLa（Thermo Scientific，Pierce™ HeLa Protein Digest Standard，88328）或K562（Promega，Mass Spec-Compatible Human Protein Extract，V6951）溶解於0.1% TFA、0.015% DDM（N-Dodecyl β-D-Maltosid，D4641-500MG，Sigma Aldrich，Germany）中，配製為5 ng/μL的濃度，用於注入LC-MS系統。
樣品使用Thermo Scientific™ Vanquish™ Neo UHPLC系統（Thermo Scientific）進行分析。肽段在50°C下采用直接進樣模式，使用Aurora Ultimate TS 25 cm納流UHPLC色譜柱（帶集成發射器；Ion Optics，Fitzroy，Australia）進行分離。
肽段分離在30–80 SPD條件下進行，具體細節見補充表1，所有單細胞測定均在50 SPD條件下完成。快速樣品加載在最大壓力1400 bar和最大流速1 μL/min條件下進行。
質譜測定中，Orbitrap Astral質譜儀或用於在Orbitrap Exploris 480質譜儀上進行基準測試的儀器（兩者均為Thermo Scientific）與液相色譜聯用。兩台儀器均配備FAIMS Pro接口（Thermo Scientific）和EASY-Spray離子源。用於重複性檢查的數據（補充圖1）是在第二台配備FAIMS Pro Duo接口的Orbitrap Astral儀器上採集的。
除非另有說明，補償電壓設定為-48（Orbitrap Astral）或-50（Orbitrap Exploris 480）。電離採用1.85 kV的電噴霧電壓；對於老化的發射器，則相應提高至略高電壓以確保噴霧穩定性。
在 Orbitrap Astral 質譜儀上，MS1 譜圖使用 Orbitrap 分析器以 240k 分辨率在 m/z 400–900 範圍內採集，AGC 目標設為 500%，最大離子注入時間為 100 ms。對於採用 Astral 分析器進行 DIA 模式下的 MS2 採集，選擇了互不重疊的隔離窗口，窗口範圍從 m/z 5（100 個細胞，10 ng）到 m/z 20（1–40 個細胞、空白樣品、250 pg 總樣），掃描範圍為 m/z 400–800。
前體離子累積時間範圍為 10 ms（100×細胞，10 ng 總樣）至 40 ms（250 pg 總樣）再至 60 ms（1–40 個細胞、空白樣品），AGC 目標設為 800%。
在 Orbitrap Exploris 480 質譜儀上，由於該儀器相較於 Orbitrap Astral 質譜儀速度和靈敏度較低，因此對 MS 方法進行了調整。然而，此前測試的高通量分析可比設置
所有原始數據均使用 Spectronaut（v 18.6.231227.55695，Biognosys AG）進行分析。
定量在 MS1 水平上進行。由於未進行烷基化步驟，因此在單細胞檢索中移除了作為固定修飾的半胱氨酸氨甲酰甲基化。除此之外，所有分析及譜庫構建均採用預設設置。檢索針對人類蛋白質組進行（UniProt proteome UP000005640，reviewed，20408 個蛋白條目，下載於 4
對於 FDR 檢查，使用 pyteomics 生成了誘餌數據庫（“shuffled target”）。
使用原始定量數值。所有缺失定量值的蛋白質均被過濾去除。
對於含 hPSC 數據集的 A459 和 TE，分別過濾掉在超過 20 個細胞和 5 個細胞中存在缺失值的所有蛋白質。其餘缺失值以數據集中最小值對應的強度進行填補。隨後將定量數據轉換為 log2 格式並歸一化至正態分佈。用於 PCA 和 UMAP 聚類的細胞直徑數據取自 cellenONE 機器人。PCA 和 UMAP 聚類使用 sklearn 完成。
為尋找 hPSC 與 TE 細胞之間的統計學差異，採用了針對兩個獨立樣本的 Student’s t 檢驗。使用 Benjamini-Hochberg FDR 對多重比較的 p 值進行校正。校正後 p 值的顯著性水平設定為 0.05。將倍數變化（TE/hPSC）大於 1 的蛋白質視為上調蛋白。上調蛋白的 GO 分析使用 String-db.org 進行。
Wicell 細胞系 H9 根據協議 20-WO-341 用於一項題為“模擬人類早期發育：建立基於幹細胞的人類囊胚三維體外模型（blastoids）”的研究項目。類囊胚的生成已獲奧地利科學院科學倫理委員會批准。儘管就胚胎模型而言，ISSCR 指南並未禁止此類研究，但本研究未超過通常與受精後連續體外培養 14 天相對應的發育階段。所有實驗均遵守所有相關指南和法規，包括 2021 年 ISSCR 指南；該指南禁止將人類類囊胚移植入任何子宮。
JAB 和 MM 提出了研究構想，設計並實施實驗，進行數據分析，並撰寫了手稿。TNA、ED 和 BD 開展了實驗並設計了實驗方案。JS 和 HK 製備了 TE 和 hPSC。JS、HK、TMS 和 NR 對 TE 和 hPSC 數據進行了解釋。PP 對數據分析策略作出了貢獻。KM 和 MM 對本研究進行了監督。所有作者均對手稿進行了修訂並同意其最終版本。
質譜蛋白質組學數據已通過 PRIDE 提交至 ProteomeXchange Consortium。
TNA、ED 和 BD 為 Thermo Fisher Scientific 的員工，其他作者聲明不存在競爭性經濟利益。
本研究獲得奧地利研究促進署（FFG）2022/01 第四輪基礎設施資助（AT-SCP）以及維也納科學技術基金（WWTF）項目 LS20-079 的支援。本研究還獲得奧地利科學基金（FWF）的 P35045-B 項目（Grant-DOI 10.55776/P35045）和 F 8801-B 減數分裂項目（Grant-DOI 10.55776/F88）的資助。本研究全部或部分由奧地利科學基金（FWF）資助。JAB 的工作由 FWF 資助（Grant-DOI 10.55776/ESP497）。
作者感謝 IMBA 的 Josef Penninger 研究團隊提供 A549 細胞。為實現開放取得之目的，作者已對因本次投稿而產生的任何作者接受稿版本適用 CC BY 公共版權許可。
標題已更新，以提高準確性。 新增了附加圖版和補充圖，以提升手稿質量。
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🏷️ 單細胞蛋白質組學 質譜分析 DIA 定量蛋白質組學 細胞異質性