人類胚胎的植入開啟了一個關鍵的發育階段，其中包括胚胎及胚外組織的深刻形態發生變化、體軸形成以及原腸胚形成事件。由於難以獲得相關樣本，我們對這一人類生命階段的機制性認識仍然有限。
解析人類胚胎發生的機制具有巨大的生物醫學意義，涵蓋從治療先天性疾病和不孕不育，到構建功能性人類器官等多個方面。植入後，胚胎及其共同發育的胚外組織經歷顯著重塑，並啟動對妊娠成功至關重要的形態學變化，包括羊膜腔的形成以及卵黃囊造血的出現。
在此，我們提出了一種來源於人類幹細胞的胚胎模型，稱為“
我們構建了一株帶有可誘導基因迴路的人誘導多能幹細胞（hiPSC）細胞系，該細胞系可表達人GATA6——一種決定胚外內胚層命運的關鍵轉錄因子（以下稱為iGATA6）(
（A）示意圖展示了在多西環素（Dox）誘導GATA6後，iGATA6（綠色）與WT（強橙色）hiPSC的細胞混合及其後續組織化過程。
（B）免疫熒光染色顯示培養體系中iDiscoid的自組織過程。比例尺 = 1000 µm
（C）一枚iDiscoid的活細胞延時成像圖像，顯示中心腔由箭頭所示的玫瑰花結結構生長形成。比例尺 = 50 µm。
（D）活體培養第4天的iDiscoid培養物的明場與熒光圖像，顯示已形成的iDiscoid形態，其中表達EGFP的iGATA6包圍WT細胞團。比例尺 = 100 µm
（E）對具有不同iGATA6覆蓋程度及腔形成特徵的WT細胞團特徵進行定量分析。未觀察到未被覆蓋的細胞團具有腔結構（-/+ = 0%）
（F）單細胞UMAP以及對第2天iDiscoid與人類和非人靈長類（NHP）胚胎單細胞數據集之間差異表達基因（DEG）列表進行的超幾何統計比較。熱圖上方的標籤表示植入前與植入後胚胎樣本的比較；標籤下方的灰色條表示NHP比較。
（G）單細胞UMAP以及對第4天iDiscoid與人類和NHP胚胎單細胞數據集之間差異表達基因（DEG）列表進行的超幾何統計比較。黑色方框標示出與相關目標細胞群具有較高DEG相似性的區域（高P值）。
為應對這些挑戰，我們旨在開發一種替代策略，通過激發hiPSC從二維到三維的自組織過程，在培養板表面生成結構。將iGATA6-hiPSC與WT hiPSC混合後，按照預定比例和細胞密度將混合細胞群接種於標準培養板上（
我們觀察到，在未被iGATA6層包圍的WT細胞團中，未見腔形成（
在初步分析中，我們觀察到，對於第5天面積較大且通常圓形度較低的WT細胞團，腔形成是通過多個腔的方式發生的。
為探究所形成細胞群體的細胞身份，我們對 iDiscoid 培養體系第 0 天至第 5 天進行了單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）。
早在誘導後 24 小時（D1），iDiscoids 中即出現了若干細胞群體（D1_G1、G2、G3），其轉錄組與人類下胚層表現出相似性，同時還存在相應的類上胚層細胞群體（D1_W1）。
在第 2 天，iGATA6 群體內觀察到與卵黃囊內胚層具有顯著統計學相似性的細胞群（簇 D2_G1、D2_G2、D2_G3、D2_G4；p = 1.3×10）。
在 WT 簇內，通過缺乏
當我們整合不同天數的所有細胞簇時，iGATA6 和 WT 譜系在投影空間中佔據了彼此不同的區室。然而，我們確實觀察到與其採樣時間相一致的人群空間定位。
靈長類羊膜發生在結構和時間上均不同於小鼠中的過程，這凸顯了對人類模型系統的需求，以為理解人類特異性發育動態提供窗口。
(A) 按發育天數標註的 iDiscoid 中所有 WT 譜系的合併 UMAP 圖。
(B) 合併後的 WT 群體顯示出表達羊膜標誌物的區室。
(C) 單個 iDiscoid 的正交切面顯示 ISL1+（青色）與 NANOG+（紅色）細胞在上下方向上的區室化分佈，而 iGATA6 細胞覆蓋頂部（白色）。
(D) 圖（C）中 WT 簇在距培養皿所示距離處的水平 z 軸切片。
(E) 示意圖顯示單個 iDiscoid 內各細胞群體的位置。虛線表示所示切片的區域。
(F) iDiscoid 中 BMP4 效應分子（磷酸化 SMAD1、SMAD5 以及 SMAD8/9）的表達模式。下方圖像顯示所示 WT 盤狀結構的側向切面。
(G) 在發育第 2 天加入抑制劑 Noggin 後，於第 4 天對 iDiscoid 進行 BMP4 效應分子（磷酸化 SMAD1、SMAD5 以及 SMAD8/9）免疫熒光染色。下方圖像顯示所示 WT 盤狀結構的側向切面。
(H) 在發育第 2 天加入 Noggin 後，於第 4 天對 iDiscoid 進行 ISL1 和 NANOG 的免疫熒光染色。下方圖像顯示所示 WT 盤狀結構的側向切面。
(I) 散點圖顯示 WT 簇內 ISL1 表達（D4）強度；比較對照（Ctrl）iDiscoid 與 BMP4 抑制（Noggin）條件。n[control] = 87，n[Noggin] = 134，**** p<0.0001
比例尺 = 100 μm。n 表示來自單次實驗、於相應日期採集的獨立生物學樣本。
進一步對 pSMAD1、pSMAD5 和 pSMAD8/9（BMP4 效應分子）進行免疫熒光染色，結果顯示 iDiscoid 中 BMP4 信號轉導呈環狀分佈，並集中於 iDiscoid 的邊緣（
綜上，我們得出結論：iDiscoids 表現出穩健的羊膜發生，並形成依賴於 BMP4 信號傳導的背腹（D-V）軸，這支援 iDiscoids 作為研究人類這一關鍵發育事件模型系統的應用價值。
(A) 所有 iGATA6 譜系合併後的 UMAP，顯示錶達前部下胚層標誌物的區室。觀察到這些標誌物存在兩個獨立區域，一個位於第 2 天 iDiscoid 細胞內，另一個位於第 3–5 天 iDiscoid 細胞內。（按天數標註的 UMAP 見補充圖 5）
(B) 所有 WT 譜系合併後的 UMAP，顯示錶達後軸和原條標誌物的區室。
(C) 免疫熒光染色顯示一個 iDiscoid 的 z 切片，其中可見與 WT 簇相鄰的 HHEX/LHX1/CER1 三重共陽性區域。虛線表示各圖像中 WT 簇的邊界，箭頭表示共陽性區域。
(D) 免疫熒光染色顯示 iDiscoid 中 WT 簇內部的 TBXT/MIXL1 雙重共陽性區域。
(E) WT 簇的示例：具有極化的 TBXT/MIXL1 區域（上）或不具有標誌物共表達（下）。維恩圖顯示了在 iDiscoid 培養中觀察到的各類簇所佔比例，總 n = 746。
(F) 維恩圖顯示當 CER1 侷限於一極時，具有特定 TBXT/CER1 極性類型的簇所佔比例。總 n = 169。
(G) 代表性 WT 簇顯示簇兩極相對的 TBXT 和 CER1 表達區域（反極性，頂部），或位於簇同一極的表達區域（同極性，底部）。
(H) 示意圖顯示了 (F) 中所示具有極化 CER1 表達區域的 WT 簇中，不同極性模式下 TBXT 的平均徑向表達模式。所有示意圖均按相同表達強度值（1 a.u.）進行縮放。角度表示沿圓形化 WT 簇周邊、相對於所示 CER1 峰值的徑向距離。陰影區域表示與極性類型對應的平均 TBXT 極性最高區域。
比例尺 = 100 µm。n 表示來自 3–4 次獨立實驗、在 iDiscoid 誘導後第 4 天收穫的獨立生物學樣本。
免疫染色鑑定出一部分圍繞 WT 簇的胚外細胞中表達前部下胚層相關蛋白（CER1、LHX1、HHEX）的細胞區域（
隨後，我們分析了 iDiscoid 培養物以評估前後軸定位情況。在第 4 天，我們觀察到，在 CER1 表達細胞呈極性構型的 iDiscoid 中，60.4±5.3%（169 箇中的 102 個）具有一個 TBXT 表達極（
接下來，我們旨在確定，在 iDiscoid 中觀察到的鄰近後部區域或位於後部區域內部的 CER1 表達，是否能夠在……期間被識別
總之，我們對 iDiscoid 的分析，結合對現有……的探索，
卵黃囊是一種多功能胚外組織，在為胚胎提供營養支援的同時，也作為早期造血的樞紐；人類發育約 E16–18 時開始出現早期血液生成，並在此後逐漸成熟。
(A) 熱圖顯示第 5 天 iDiscoid 的 scRNA-seq 細胞群與人類 E16–19 胚胎中的造血細胞群的比較。
(B) 點圖顯示第 5 天 iDiscoid 的 scRNA-seq 細胞群中造血標誌物的表達模式。
(C) 免疫熒光圖像顯示了 iDiscoid 培養中表達 CD34 和 TAL1（scl）的細胞分佈。表達 TAL1 的細胞定位於卵黃囊內胚層區室與組織培養皿之間，並形成梭形細胞排列。正交切片顯示了梭形細胞貼附於培養皿的位置。虛線表示取得該切片的位置。
(D) 第 12 天拍攝的活體相差圖像顯示了在 iDiscoid 組織內產生的球形細胞。虛線框表示插圖區域。
(E) 第 12 天 iDiscoid 的免疫熒光圖像顯示，CD31+ 內皮細胞內生成了 CD43+ 球形細胞。
(F) 第 12 天 iDiscoid 的免疫熒光圖像，其中以 25% 的 GATA6 高表達細胞替代了正常 iDiscoid 比例中的相應細胞。
(G) 直方圖顯示了在以給定比例替代 GATA6 高表達細胞的實驗中檢測到的 CD43+ 細胞數量。n[0%] = 4 個實驗重複，n[10%] = 2 個實驗重複，n[25%] = 2 個實驗重複。
(H) 來自單個類血島結構的兩張切片顯示，Desmin+ 中胚層細胞和 CD34+ 內皮細胞定位於 FOXA2+ 內胚層下方。
(I) 直方圖顯示了所示標誌物在培養皿底部與培養物頂部之間沿 z 軸的分佈。FOXA2 的雙峰分佈表明其在類血島灶之外的區域也存在表達。該分佈為來自 3 個技術重複中 9 個灶的平均值。
(J) 一個血島區域的三維重建圖像顯示了內胚層（FOXA2）、內皮（CD34）和中胚層（Desmin）標誌物的空間定位。
(K) 示意圖描繪了體內胚胎卵黃囊血島以及體外 iDiscoid 卵黃囊類血島結構。
在第 5 天 iDiscoid 中觀察到早期造血潛能後，我們將 iDiscoid 培養延長至第 5 天之後，以更好地考察該系統的造血潛能。我們觀察到，當培養在 mTeSR 條件下維持時，CD34+ 區域僅發生了極小程度的擴增。
對第 12 天觀察到的細胞類型進一步研究表明，存在帶有卵黃囊來源髓系譜系標誌的細胞，包括巨噬細胞（CD33
本文所述的 iDiscoid 同時發育出胚內和胚外譜系，並呈現出若干此前首次在一種
從工程學角度看，iDiscoid 平台凸顯了組織生態位工程和共分化在促進形態發生事件方面的強大能力。
本研究經匹茲堡大學人類幹細胞研究監督委員會批准並在其監督下開展。本研究所報告的工作遵循了 2016 年《幹細胞研究與臨床轉化指南》以及 2021 年 ISSCR《幹細胞胚胎模型倫理標準指南》。
所有細胞和組織均在 37°C、5% CO₂ 的濕潤培養箱中培養。
先前構建的表達 rtTA 的 PGP1 hiPSC。
將經 GATA6 工程化的 hiPSCs 與表達 rtTA 的 PGP1 hiPSCs 按 81:5 的比例接種，後者可含有或不含有 mKate 報告基因，總接種密度為每平方釐米 54,000 個細胞。
未誘導的 iDiscoid 細胞在匯合度達到 70% 時，用 Dispase 處理 10 分鐘，或處理至可見菌落邊緣翹起。隨後用 DMEM/F-12 清洗細胞兩次，再以手工方式將菌落從培養板上刮下。菌落以 300g 離心 5 分鐘，隨後重懸於 Cryostor 10 中。細胞先於 −80°C 條件下冷卻 24 小時，再轉移至液氮中進行長期保存。細胞在復甦前於液氮中至少保存 24 小時。
在 iDiscoid 培養第 2 天，通過向常規培養基中加入 100 ng/ml Noggin 抑制 BMP4 信號通路。在後續各天更換的培養基中均補加該濃度的 Noggin。
細胞培養於鋪有 Matrigel 的直徑 8 mm 圓形玻璃蓋玻片、14 mm 玻片底培養皿（Mattek Corporation）或 8 孔 µ-Slide（ibidi）上。培養物在室溫下用 4% 多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences）固定 10 分鐘。隨後將蓋玻片用 PBS 清洗 3 次，並以 PBS 中含 0.2% Triton X-100 的通透液處理 15 分鐘。
之後，蓋玻片在洗滌緩衝液（PBS 中含 0.05% Tween-20）中每次 5 分鐘清洗 3 次，並在 200 ml 洗滌緩衝液加 5% 正常驢血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories）中封閉 20 分鐘。將一抗稀釋於 PBS 中含 5% 正常驢血清的溶液中，於室溫下與組織孵育 1 小時，隨後在洗滌緩衝液中每次 5 分鐘清洗 3 次。
將二抗稀釋於 PBS 中含 5% 正常驢血清的溶液中，於室溫下與組織孵育 1 小時，隨後在洗滌緩衝液中每次 5 分鐘清洗 3 次。之後，將 8 mm 蓋玻片使用 ProLong Glass Antifade（Life Technologies）封片於顯微鏡載玻片上，在室溫下固化過夜，並以指甲油封固。位於玻片底培養皿或 µ-Slide 中的蓋玻片置於 4°C 的 PBS 中保存，以用於三維成像。
圖像使用 EVOS M700 自動掃描顯微鏡、Leica SP8 共聚焦顯微鏡、Sartorius Incucyte 活細胞成像系統或 Nikon A1 共聚焦顯微鏡採集，並使用 Fiji/ImageJ 軟件（NIH）進行處理。
拼接獲得的整張蓋玻片圖像被裁剪為中央內接正方形區域（通常為 9000 μm）。
通過從分區邊界向各分區質心方向繪製一條預定義距離的線，並記錄該範圍內每個點處各標記物的強度值，對從分區周邊向內的標記物表達進行了分析。若所繪製的線會與分區邊緣相交（例如從凹形結構的外緣進行繪製時），則跳過這些數值。對每條線記錄的強度值取平均，以生成最終的每分區表達分佈。在存在CER1表達峰值時，這些分佈基於CER1最大表達點進行對齊，並使用MATLAB中的imresize函數將各分佈長度統一為所記錄的最長邊界長度。
WT簇的覆蓋情況通過拍攝整個蓋玻片的寬場圖像進行評估。在WT簇內部觀察到EGFP表達且其面積大於該簇面積50%的區域被計為已覆蓋。腔隙/空腔的存在與否通過人工評估，並依據野生型分區內是否存在可見的PODXL、ZO-1或F-actin表達環來判定。
WT圓盤內的ISL1表達通過對上述方案獲得的徑向表達值取平均進行記錄。
圍繞WT分區的TBXT和CER1結構域極性按如下方式評估：首先，將徑向簇分析得到的CER1和TBXT原始值通過除以各點測得的F-actin強度，按細胞密度進行歸一化。隨後，對於每個圓盤周圍記錄的每一個點，計算距該點沿圓盤周向任一方向各1/8圓盤半徑範圍內所有點的CER1和TBXT值的平均值。標記物陽性通過比較滾動平均值的最小值和最大值來判定；若其差值大於0.1歸一化強度單位（a.u.），則認為該標記物為陽性。
對於陽性島，比較CER1最高平均象限值的徑向角度索引與TBXT最高平均象限值的徑向角度索引：若WT分區中TBXT的平均峰值位於距CER1峰值135°至225°之間，則認為其為反極性；若TBXT峰值位於CER1峰值45°範圍內，則認為其為同極性。每個島的極性類型歸類均通過人工目視加以驗證。
每種標記物的整個蓋玻片免疫熒光圖像先裁剪為正方形，然後劃分為等面積象限以便於分析。WT簇掩膜通過在Fiji/ImageJ中進行手動閾值分割並創建二值圖像生成。隨後，利用這些二值圖像，並通過對各單獨通道圖像應用Image Calculator功能，將WT簇從圖像中去除。所得圖像隨後使用CellProfiler中的自定義流程進行分析。
在每個已識別區域的近中心位置採集共聚焦 z 軸堆棧圖像。對於每個堆棧，底部被定義為能夠識別到清晰聚焦標記物的最低 z 軸索引。將底部索引以上每個切片內所有像素的像素強度值求和後，再除以像素數。隨後，對所有已識別樣本中各對應 z 軸索引處所得數值取平均；再將這些數值轉換為相對於最大值的百分比，以生成所示圖表。
使用商業化 ELISA 試劑盒（abcam）對樣本中的 AFP 和 APOA1 進行檢測。對樣本稀釋倍數進行了優化，以確保各項檢測均處於各自標準曲線的線性檢測範圍內。
對於細胞活率 >80% 的樣本，按照 10x Genomics 單細胞 RNA 測序細胞多重寡核苷酸標記方案中的 Cell Multiplexing Oligo Labeling Protocols 所述方法制備樣本。將各所示日期的 iDiscoids 於 37°C 下用 Accutase 孵育 20 分鐘，以獲得單細胞懸液。細胞懸液經 40 μm 濾網過濾以去除細胞聚集體。隨後，每份樣本懸液在室溫下以 300g 離心 5 分鐘。使用 P1000 移液器手動吸除各樣本上清。
將每個細胞沉澱重懸於 1 ml PBS + 0.04% BSA 中，並在室溫下以 300g 離心 5 分鐘。隨後將樣本重懸，目標濃度為 1×10
隨後，樣本在室溫下以 300g 再次離心 5 分鐘。使用 P1000 移液器手動吸除上清。將樣本重懸於 50 μl CellPlex Multiplexing Solution（10x Genomics）中，併為每個樣本分配唯一的多重寡核苷酸溶液。最多可同時對 12 份樣本進行標記。自最後一份樣本加入寡核苷酸溶液後開始計時，樣本孵育 5 分鐘。
標記後，向每份樣本中加入 1.95 ml 1× PBS + 1% BSA，並充分混勻。每份樣本在 4°C 下以 300g 離心 5 分鐘。使用 P1000 移液器手動吸除上清，並儘可能使每份樣本中殘留上清少於 10 μl。將樣本重懸於 2 ml 1× PBS + 1% BSA 中並充分混勻以進行清洗。該清洗及離心步驟另外重複兩次；最後一次重懸時，加入足量清洗緩衝液，使細胞計數達到 1×10
在最終計數和活性分析完成後，將細胞和 10x Genomics 試劑加載至單細胞芯片中，以 25,000 個單細胞作為分析目標，同時考慮到《Chromium Single-Cell 3’ Reagent Kit（10x Genomics）》用戶指南中所述的、由多重化導致的預期細胞損失和雙細胞事件。在生成 GEMs 後，Pitt Single Cell Core 的工作人員按照 10x Genomics 用戶指南中規定的相應步驟製備 cDNA 文庫。
文庫隨後送至 UPMC Genome Center，使用 NovaSeq S4-200 進行測序，目標測序深度為每個細胞 100,000 條 reads，採用 150 bp 雙端測序。我們對測序數據進行下游分析後發現，不同樣本中每個細胞的平均 reads 數介於 40k–150k 之間。
採用 10x Genomics CellRanger 流程將 reads 比對至附加了轉基因序列的參考基因組（GRCh38.84），將 reads 分配至單個細胞，並基於 UMI 計數估算基因表達量。
基於線粒體基因組轉錄本比例較高，以及 feature 數或 UMI 計數過高或過低的標準，排除了部分單細胞數據。UMI 計數出現在少於 5 個細胞中的基因被移除，不納入後續分析。對於使用 Seurat 進行的 scRNA-Seq 數據處理和聚類分析
我們採用用於過度富集分析的超幾何檢驗來量化兩組標記基因列表 A 和 B 之間的相似性。這等價於單尾 Fisher 確切檢驗。
用於計算圖中柱狀圖 p 值的統計檢驗為
細胞使用 accutase（StemCell Technologies）消化為單細胞懸液。CD34
集落形成單位實驗的輸入和輸出細胞均通過流式細胞術進行免疫表型分析。細胞與人源抗 CD235a、抗 CD71、抗 CD45、抗 CD11b 和抗 CD34 抗體（BioLegend）在冰上孵育 30 分鐘進行染色。隨後使用 LSR II 流式細胞儀（BD Biosciences）對細胞進行分析，並採用 7-AAD（ThermoFisher Scientific）作為死細胞染料。數據分析使用 FlowJo 軟件完成。門控策略示例見補充圖 21。
為製備樣本，在 6 孔板中的 4–6 個孔內培養 iDiscoids，並在進行 CD34 之前將樣本合併。
本研究期間產生和/或分析的數據集可在合理請求下向通訊作者取得。
J.H.和M.R.E.構思了本研究；M.R.E.、Z.B.J.、B.S.和S.K.監督了該項目；J.H.、M.R.E.、S.K.、A.A.、K.K.F.、J.V.、R.L.、D.S.和Z.B.J.構思了實驗方法學；J.H.、R.S.、K.K.F.、J.V.、R.L.、M.N.T.和M.R.進行了iDiscoid實驗；J.H.、R.S.、K.K.F.、T.M.、M.N.T.、S.W.和D.S.進行了成像與分析；J.H.、A.A.和Q.S.進行了scRNA-seq數據集的生物資訊學分析；R.L.和K.K.F.進行了流式細胞術及分析；J.H.、A.A.、K.K.F.、J.V.、R.L.、D.S.和M.R.E.進行了數據可視化；M.R.E.、S.K.、Z.B.J.和J.H.為該項目取得了經費；J.H.和M.R.E.撰寫了論文初稿；J.H.、R.S.、K.K.F.、M.R.E.、B.S.、S.M.C.S.L.、A.A.、J.V.、S.K.和Z.B.J.參與了論文終稿的編輯並提供了意見。
J.H.、S.K.和M.R.E.已就此處所展示的技術提交了知識產權申請。
（A）用於構建可誘導表達GATA6的iPSC的基因迴路。pConst為組成型活性啟動子。
（B）通過流式細胞術分析檢測到的iGATA6細胞中EGFP（GATA6）啟用的異質性。更高的基因迴路拷貝數會導致更高水平的EGFP和GATA6表達。
（C）iGATA4與WT的3D培養顯示，羊膜標誌物ISL1與多能性標誌物NANOG在WT層中廣泛共表達，且未出現背腹軸極化。中間切片顯示中央腔的形成。
（D）iGATA4與WT的3D培養顯示，多能性標誌物NANOG在整個WT層中表達，但這些3D組織中有相當一部分缺乏ISL1表達。這些球體同樣未表現出極化。
（E）示意圖顯示了3D條件下以及由2D>>3D形成的iDiscoid發育過程，並與胚胎形態進行了比較。iDiscoid類似於一個扁平化的卵黃囊腔，具有上胚層界面和羊膜腔。
（A）固定培養物的免疫熒光圖像顯示了GATA6誘導後第0天至第3天期間iGATA6（綠色）和WT（NANOG）hiPSC的細胞組織情況。隨着iGATA6細胞獲得更類似卵黃囊內胚層的形態，PDGFRα在這些細胞中升高。
（B）GATA6誘導後第0天至第3天，iGATA6/WT共培養中單一位置的延時成像圖像。上方裁剪圖像對應於下方圖像中白框所示的位置。比例尺 = 200 μm。
（C）延時成像圖像顯示，在iDiscoid誘導後D2之前，紅色WT細胞最初被綠色iGATA6細胞限制，隨後iGATA6細胞遷移覆蓋WT盤面。
（D）兩個代表性iDiscoid的Z軸切片顯示了OCT4、GATA4和SOX17在iDiscoid培養中雙層盤狀區域內的定位，以及至第5天中央腔的形成。
(A) 免疫熒光圖像顯示了誘導後 iDiscoid 發育第 1、3 和 5 天 LAMA1 沉積的動態變化。虛線框標示了第 3 天和第 5 天圖像中第四個面板插圖所對應的區域。
(B) 時間過程圖顯示了在 iDiscoid 發育前 5 天中，免疫熒光圖像內 LAMA1 信號的增強。散點表示在單次實驗中於每天收集樣本後隨機選取的區域。
(C) 免疫熒光圖像顯示，在具有中央腔的 WT 簇周圍存在層粘連蛋白沉積，同時 PODXL 發生極化。
(D) 免疫熒光圖像顯示了一個代表性 WT 簇的水平切片和側向切片，其中 PODXL 和 ZO-1 朝向中央腔發生極化。
(E) 第 3 天 WT iPSC 的一個代表性細胞簇。在該細胞簇周圍未觀察到層粘連蛋白沉積。
(F) ELISA 比較了在 Dox 誘導 GATA6 後第 0 天（D0）和第 5 天（D5）檢測到的分泌型 AFP 和 APOA1。單個散點表示生物學重複。
(A) 在具有 iGATA6 覆蓋的 iDiscoid 中，WT 簇面積相對於所觀察到腔數量的分佈。陰影區域表示 Hertig and Rock，1949 以及 Heuser 等，1945 記錄的 E9 至 E17 雙胚層胚盤面積範圍；觀察到的胚盤中有 64% 的面積落在該範圍內，39.8% 具有單一腔結構。33.2% 同時符合這兩個類別。總 n = 331。
(B) 在具有 iGATA6 覆蓋的 iDiscoid 中，WT 簇圓形度相對於所觀察到腔數量的分佈，並附有一個具有所示特徵的 iDiscoid 代表性圖像。N = 331，比例尺 = 100 μm。
(C) 熱圖顯示了由不同初始接種密度的 iGATA6 和 WT 產生的 iDiscoid 的平均面積。虛線框標示了用於 iDiscoid 實驗的優化接種密度。
(D) 熱圖顯示了由不同初始接種密度的 iGATA6 和 WT 產生的 iDiscoid 的平均圓形度以及每 mm2 的平均胚盤數量。虛線框標示了用於 iDiscoid 實驗的優化接種密度。
(E) 按照 C 中所示優化比例接種時，在具有 iGATA6 覆蓋的 iDiscoid 中，WT 簇面積相對於所觀察到腔數量的分佈。陰影區域表示 Hertig and Rock，1949 以及 Heuser 等，1945 記錄的 E9 至 E16–19 雙胚層胚盤面積範圍；有 74% 的胚盤落在該面積範圍內。89.7% 的胚盤具有單一腔結構。70.9% 的胚盤同時符合這兩個類別。總 n = 79。
(A) iDiscoid 發育過程中截至第 5 天各時間點的單獨 UMAP 投影及聚類結果。
(B) 小提琴圖顯示了 iDiscoid 第 0、2 和 4 天各簇中的一組人工篩選基因。iDiscoid 各簇按 GATA6 表達水平由低到高排序。“W”簇為推定野生型譜系的細胞簇；“G”簇為推定 iGATA6 譜系的細胞簇。
（A）將每個 iDiscoid 天數與 Tyser 等人（2022）註釋的人類胚胎細胞群進行超幾何統計比較。每列上方的藍點表示該天數中所示各細胞群的相對 GATA6 表達水平。
（B）將每個 iDiscoid 天數與 Xiang 等人（2020）註釋的人類胚胎細胞群進行超幾何統計比較。所使用的尺度與 A 圖相同。
（C）將每個 iDiscoid 天數與 Ma 等人（2019）註釋的食蟹猴胚胎細胞群進行超幾何統計比較。所使用的尺度與 A 圖相同。
iDiscoid 簇對應於擴展數據圖 5 中按天分別聚類得到的簇，並按 GATA6 表達水平從低到高沿 x 軸自左向右排列。“W”簇為推定野生型譜系的簇；“G”簇為推定 iGATA6 譜系的簇。虛線輪廓表示每個簇中最值得關注的命運比較。
其他數據集中的縮寫：NNE = 非神經外胚層，DE（P）= 確定性內胚層（增殖型），DE（NP）= 確定性內胚層（非增殖型），YS = 卵黃囊，PGC = 原始生殖細胞，CTB = 細胞滋養層，STB = 合體滋養層，EVT = 絨毛外滋養層，PSA-EPI = 上胚層中的原條始基，EXMC = 胚外中胚層細胞，E- = 早期，L- = 晚期，Gast = 原腸胚形成細胞，AM = 羊膜，VE/YE = 內臟內胚層/卵黃囊內胚層
（A）顯示按天註釋的合併 iDiscoid 簇的 UMAP 圖。
（B）顯示應用無監督聚類後的合併 iDiscoid 簇的 UMAP 圖。
（C）顯示合併的第 0 天至第 5 天數據集中各簇對應前 20 個基因的熱圖。
（A）第 4 天羊膜標誌物 ISL1 和 AP-2α 的免疫熒光染色。展平蓋玻片的俯視寬場圖像。比例尺 = 100 μm
（B）第 4 天 iDiscoid 單細胞 RNA 測序中 BMP 通路標誌基因的點圖。BMP4 表達及若干相關基因（紅框標出）在類羊膜細胞群中最高。
（A）對照 iDiscoid 顯示出 TBXT+ 後部結構域和表達 CER1 的 LHX1+ 區域的發育。
（B）在第 2 天加入 100 ng/mL Noggin 的 iDiscoid 顯示存在表達 CER1 的 LHX1+ 區域，但不表達 TBXT+ 結構域。在 WT 圓盤周邊的 iGATA6 譜系細胞中可見 TBXT 表達。
（A）一個具有代表性的 WT 簇顯示，TBXT 和 CER1 分別在 WT 簇和 iGATA6 層內呈現 syn-極性。實心箭頭表示 iGATA6 層內表達 CER1 的細胞；空心箭頭表示 WT 層內共表達 CER1 和 TBXT 的細胞。Z 切片為來自兩個不同 WT 圓盤中心區域的代表性切片。
(B) 代表性WT簇顯示，在WT簇和iGATA6層內分別存在TBXT與CER1的反極性分佈。實心箭頭表示位於iGATA6層內的CER1表達細胞；空心箭頭表示位於WT層內的CER1與TBXT共表達細胞。Z切片為取自WT圓盤中心的代表性切片。
(C) 上圖顯示了所有D0–D5 scRNA-seq數據合併後的UMAP，顯示錶達抑制因子CER1的後部區室。虛線框標示WT譜系。後部區域示意於
(A) Bergmann等人（2022）報道的CS5和CS6狨猴胚胎中TBXT與CER1的空間表達。在狨猴CS5階段，CER1在覆蓋胚盤的胚外內胚層中呈高水平且無極性表達；到CS6階段，其總體表達下降，並觀察到極輕微的、遠離推定後部的極化。自CS5至CS6，TBXT在胚盤內由無區域化/雙極表達轉變為在胚盤一極的強表達。
(B) Tyser等人（2022）報道的人類E16–19（CS7）胚胎中TBXT與CER1的區域表達。TBXT和CER1的最高表達可見於胚胎尾側部分，該區域對應於原條所在區域及覆蓋其上的下胚層，如示意圖所示。
(C) Cui等人（2022）報道的食蟹猴E18–E20胚胎中TBXT與CER1表達的偽空間表示。右側示意圖顯示了經顯微解剖的胚胎切片，並標註了與各鑑定組織層對應的標籤。CER1表達在下部胚胎區（EM-Low）和中部胚胎區（EM-Mid）區域層中與TBXT表達高度重疊。
(D) 小鼠E6.5–E8.5胚胎中T和Cer1的表達水平。在原條前部區域內存在顯著的共表達。
(E) 來自153個覆蓋E6.5–E7.5階段小鼠胚胎的前部原條元細胞中T和Cer1的表達水平。在這一代表性細胞/細胞類型中，T和Cer1隨時間在原條前部共同升高。
(F) 約E6.5–E7.5小鼠胚胎中T和Cer1的空間表達水平。這些標記在後部區域前端附近的區域中共表達。示意圖中的方框區域對應並突出顯示了這一範圍。右側示意圖顯示了左側示意圖Y軸第3索引平面上各標記的表達模式。
(A) 小提琴圖顯示了第5天iDiscoid scRNA-seq簇中ECM基因以及卵黃囊中胚層標誌基因BST2的分佈。
(B) 點圖顯示了第5天卵黃囊中胚層和內皮標誌基因的一個子集。GATA6表達最高的細胞群體表達最高水平的YSM標誌基因。左側顯示GATA6表達，其圓點大小的縮放方式與右側標誌基因列表不同。
(A) 散點圖顯示了第5天時通過對3次獨立實驗進行圖像分析所獲得的標誌物分佈。百分比對應於記錄到的、相應標誌物表達水平高於虛線所示閾值的細胞比例。
(B) 免疫熒光圖像顯示了 iDiscoid 培養中表達造血標誌物的細胞。表達造血標誌物 TAL1（Scl）的細胞定位於卵黃囊內胚層區室與組織培養皿之間。比例尺 = 100 µm
(C) 免疫熒光圖像顯示錶達 RUNX1 和 TAL1 的細胞貼附於培養皿表面。比例尺 = 100 µm
(D) 對3個生物學重複中5個區域的 z 層切片進行圖像分析。代表 iGATA6 內胚層的 EGFP 表達峰之下可見 ERG 表達峰。虛線曲線表示在各點計算得到的標準誤（SEM）。
(E) 免疫熒光圖像顯示錶達 VE-cadherin 和 VEGFR2 的細胞貼附於培養皿表面。箭頭指示一個可能來源於上覆 iGATA6 層的分化中的內皮細胞。比例尺 = 100 µm
(F) 流式細胞術圖顯示了在以表達 CD34 的細胞（從 iDiscoids 中富集）起始的 CFU 測定後第14天檢測到的造血標誌物。
(G) 圖像分析結果顯示了 iDiscoid 培養第5天至第12天期間 CD34+ 細胞面積的變化，該結果通過免疫熒光圖像分析評估得出。單個點代表生物學重複。**：P 值 = 0.0055
(H) 第5天和第12天 iDiscoid 的代表性流式細胞術圖顯示，到第12天 CD34+ 細胞群發生擴增（n=3）。
(A) 第12天 iDiscoids 中一部分 CD43+ 圓形細胞表達紅系標誌物（CD235a 和 Hemoglobin）。比例尺 = 100 µm
(B) 細胞表達髓系標誌物（CD31、CD33）和巨噬細胞標誌物（CX
(C) 第12天 iDiscoid 中表達巨核細胞標誌物的細胞。比例尺 = 100 µm
(D) UMAP 顯示了在第21天進行的 scRNA-seq 的無偏聚類。方框區域顯示錶達造血標誌基因的細胞群。
(E) 將第21天 iDiscoid 細胞群與 Tyser 等人（2022）報道的人類胚胎 E16–19 細胞群進行超幾何統計比較。紅框顯示了與體內造血譜系具有相似性的目標細胞群。iDiscoid 各聚類在 Y 軸上按相似命運進行分組。
(F) 圖 D 中紅框所示細胞群內造血標誌基因的表達。這4個聚類顯示出與卵黃囊來源造血細胞群相關的不同標誌基因表達譜。
(G) 第21天 iDiscoid 的流式細胞術分析。在對所示標誌物進行分群之前，先對細胞進行 CD43 陽性門控（n=2，顯示代表性樣本）。
(A) 在未額外補充 GATA6-hi 細胞的情況下，第 12 天 iDiscoid 中 CD43+ 和 Hemoglobin+ 細胞的表達。Hoechst 高信號區域中的紅色為非特異性染色。比例尺 = 500 μm。插圖顯示 CD43+ 細胞區域。右側虛線輪廓顯示圖像中放大區域的位置。比例尺 = 100 μm
(B) 在初始接種時補充 25% GATA6-hi 細胞的情況下，第 12 天 iDiscoid 中 CD43+ 和 Hemoglobin+ 細胞的表達。可觀察到 CD43 表達細胞的顯著擴增。比例尺 = 500 μm。圖示為 2–4 個生物學重複中的代表性圖像。
(A) 第 12 天 iDiscoid 在距底部焦平面所示高度處的 Z 層切片。中胚層標誌物 Desmin 的表達侷限於組織底部附近；內皮標誌物 CD34 在組織底部和中部附近表達，且在 Desmin 上方（z = 6–8）表達最高；內胚層標誌物 FOXA2 僅在其他組織上方表達。比例尺 = 50 μm
(B) 圍繞 (A) 中所示類血島區域的 Z 層切片
從初始混合狀態開始，iDiscoid 細胞分離形成由 iGATA6 細胞包圍的 WT 細胞簇。這些 iGATA6 細胞發生側向遷移，在 WT 細胞簇頂部形成雙層邊界。隨後，這些細胞簇經歷腔形成、羊膜樣細胞命運指定以及前部下胚層樣和後部結構域的形成。在僅含 iGATA6 的區域中，卵黃囊中胚層發生命運指定，並可觀察到造血細胞命運指定。
(A) 在 iDiscoid 中，第 12 天大多數對應於先前 WT 細胞簇的結構已開始表達 ISL1，並失去多能性標誌物 SOX2 和 NANOG 的表達。少數細胞在先前 WT 細胞簇的核心區域表達 SOX2，這可能提示少量 WT 譜系細胞被指定為外胚層樣命運。
(B) 先前 WT 細胞簇中的一部分已獲得外胚層分化標誌物的表達。比例尺 = 500 μm
(A) 示意圖顯示 iDiscoid 親本細胞系的構建過程。攜帶可誘導 GATA6 迴路且拷貝數異質的 iGATA6 細胞與野生型細胞混合。隨後，該細胞組合在誘導前共同維持培養或凍存，用於 iDiscoid 實驗。
(B) 經冷凍保存和復甦後的 iDiscoid 形態及特徵。比例尺 = 500 μm
(C) 混合後立即誘導（傳代 1）或共同維持培養並傳代兩個月（傳代 15）的 iDiscoid 培養物的特徵和形態。比例尺 = 500 μm
使用 iPSC 細胞系 PGP9 構建的 iDiscoid 在第 4 天的免疫熒光圖像。
(A) 部分表達高水平 GATA6（EGFP）的 PGP9 iGATA6 細胞在 WT 細胞簇邊緣附近也表達前部內胚層標誌物 HHEX。
(B) PODXL 表達形成環狀，襯於 PGP9 WT 細胞簇中形成的腔體內側。
(C) ISL1+ 細胞在遠離 NANOG+ 細胞的位置發生命運指定，沿着 PGP9 WT 中形成的腔體基部排列。
（D）TBXT+細胞在WT細胞簇邊緣形成極性結構域。代表性細胞島顯示，可觀察到細胞的同向極性排列和反向極性排列兩種情況。
（方法中引用）通過SSC-A與FSC-A門控排除細胞碎片；通過比較FSC-A與FSC-H排除細胞聚集體；利用7-AAD染色識別陽性細胞並將死細胞門控排除。
本研究得到了匹茲堡大學病理學系啟動基金的支援。我們感謝生物成像中心和匹茲堡大學流式細胞術核心設施提供的支援。造血細胞亞群的表徵部分得到了美國國家心肺血液研究所（National Heart, Lung, and Blood Institute）授予M.R.E.的R01項目（HL141805）的支援。
本研究中所使用的iPSC細胞系的建立與表徵部分得到了美國國家生物醫學成像與生物工程研究所（National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering）授予M.R.E.的R01項目（EB028532）以及美國國家科學基金會（NSF）項目#2134999的支援。
已發表胚胎數據集的計算分析部分得到了美國國立衛生研究院（NIH）授予Z.B.J.的項目1R01GM122096、OT2OD026682、1U54AG075931和1U24CA268108的支援。本研究還部分得到了匹茲堡肝臟研究中心（NIH/NIDDK P30DK120531）、組織工程與再生醫學細胞方法培訓項目（T32 EB001026）以及NIH 1S10OD019973-01的支援。
我們感謝生物成像中心的Katherine Helfrich和Michael Calderon在成像相關工作中提供的幫助。我們還感謝Alaina Sutherland、Chloe Hislop和Raini Porterfield在本研究期間提供的有益討論。文中展示的若干示意圖使用Biorender製作。
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📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.15.545118
🏷️ 胚胎植入後發育 人類幹細胞模型 胚外組織工程 GATA6誘導 自組織形態發生