頂端-基底極性的建立與維持是腦發育中的一個基礎步驟，指導神經祖細胞（NPCs）以及發育中大腦皮層的組織構建。尤其是，位於基底側的細胞外基質（ECM）對這一過程至關重要。在體外， epithelial 極化可通過內源性 ECM 產生或外源性 ECM 補充來實現。儘管大腦類器官能夠重現神經上皮發育，但不同 ECM 來源對組織形態發生的影響仍未得到探究。在此，我們表明，在神經上皮早期階段暴露於外源性 ECM 會導致組織快速極化，並在 3 天內引發神經上皮結構的完全重排。
在未暴露的培養條件下，NPCs 通過內源性 ECM 的產生，在較長時間內逐步獲得極性。神經發生啟動後，組織結構和神經元分化在很大程度上獨立於初始 ECM 來源。這些結果增進了對體外神經上皮生物學的認識，重點關注外源性與內源性引導的形態發生機制。研究結果表明，神經上皮培養可通過內源性過程實現自我維持，這促使人們迫切重新評估在這些模型系統中不加區分地使用外源性 ECM 的做法。
上皮形態發生是包括腦在內的多個器官發育過程中的關鍵步驟（
極化過程依賴於鄰近細胞與細胞外基質（ECM）蛋白所介導的協調信號。特別是，基底膜蛋白是與細胞表面相關的 ECM，排列於上皮組織的基底表面，提供啟動並維持極性的線索（
神經上皮生成、形態發生和分化的關鍵特徵可通過腦類器官這一發育中人腦區域的三維模型得以重現（
在本研究中，我們考察了人端腦類器官發育過程中不同外源性 ECM 暴露方式的影響。我們採用了 Matrigel，這是一種從小鼠 Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤中提取的 ECM 製劑（
為評估 ECM 補充如何影響類器官早期發育，我們在神經上皮化開始時（第 10 天，D10）以 Matrigel 形式提供外源性 ECM（exECM）。Matrigel 的施加方式包括：作為固體液滴提供對聚合化 ECM 蛋白網絡的長期暴露（液滴包埋，exECM
所採用的三種類器官方案總結（見材料與方法）、分析時間點以及相關發育里程碑。共同來源的一批胚樣體（EBs）在 D10 被分配至三種實驗條件：包埋於 Matrigel 液滴中（exECM
為評估類器官發育、生長和形態的一般特徵，我們採用了縱向明場顯微成像（
不同細胞系之間具有可比性的形態學變化包括：D10 時外層變亮、exECM 條件下的組織出芽
為了解外源性 ECM 暴露是否會改變神經上皮形態，我們評估了神經祖細胞的早期組織情況。為了可視化組織內單個 NPC 的位置，我們使用了 H9 衍生的報告細胞系，其中綠色熒光蛋白的表達由 SOX2 啟動子驅動（SOX2::SOX2-p2A-EGFP，下文簡稱 SOX2::EGFP），以標記真正的神經祖細胞（
採用由 80% WT H9 ESC 和 20% SOX2::EGFP 組成生成的類器官，在 D10 時用於可視化單個神經祖細胞
在 D10 時，整個 EB 組織中均可見小的中空區域——空腔形成位點——提示結構不對稱性的初始發生點（
頂端域和基底域分別由 PKCζ 和 FN 標記。在 exECM 中，於 D13 建立了頂端向內/基底向外的極性軸
為了理解驅動 NPC 極化時間進程的因素，我們評估了 PKCζ 和纖連蛋白（FN）的位置，它們分別是頂端域和基底域的標誌物（
頂端域和基底域分別由 PKCζ 和 FN 標記。在 exECM 中建立了頂端向內/基底向外的極性軸
頂端域和基底域分別由 PKCζ 和 FN 標記。在所有條件下均建立了頂端向內/基底向外的極性軸。底部面板：插圖區域放大圖。
發育中腦內存在的若干 ECM 蛋白
為了評估神經上皮形成初始差異是否會影響神經祖細胞與神經元的相對組織，我們在神經發生階段對類器官進行了評估。無論是否暴露於外源性 ECM，最早出現的神經元（MAP2
所有條件和細胞系來源的類器官均顯示出豐富的、具有 PKCζ 標記的神經玫瑰花樣結構
（A）D40 時組織結構的示意圖。可見大量神經玫瑰花樣結構以及較小的視杯組織區域。（A’）背側皮層玫瑰花樣結構組織的示意圖。（B）所有條件下的類器官均顯示出豐富的、具有 PKCζ 標記的神經玫瑰花樣結構
由方案變異性或非期望外源性線索導致的組織錯誤模式化，可能會造成類器官內出現不希望出現的區域命運。在檢查 D40 時類器官形態的過程中，我們識別出了一些未組織成神經玫瑰花樣結構的區域，這些區域表現得更加迂曲和無序（
類器官建模的主要目標之一，是獲得發育中神經組織的成熟特徵。因此，為了評估早期差異性暴露於外源性 ECM 對類器官成熟的潛在長期影響，我們在不同類型成熟神經元已出現的發育階段（D120）研究了類器官的細胞組成。值得注意的是，儘管到這一時間點類器官組織已完全長出早期添加的 exECM，Matrigel 在 exECM 中仍可見為大的實性團塊
UMAP 投影中的無監督聚類鑑定出兩個主要簇（
為了驗證所有細胞系和條件下的細胞類型組成，我們採用了免疫染色（
上皮形態發生涉及多個過程的連續協調，包括由細胞-細胞外基質（ECM）和細胞-細胞相互作用介導的組織極化，以及腔的形成、維持和擴張（
在此，我們表徵了外源性ECM是否存在如何影響人端腦類器官的發育。我們發現，在缺乏外源性ECM（exECM）的情況下，早期空泡化位點會啟動組織不對稱性，並且很可能是玫瑰花結腔的起始點。這些觀察提示了一種類似於繼發性神經胚形成的機制
儘管極化和腔形成會自發出現
另一個重要結論是，以凝膠化基質形式存在的Matrigel暴露（exECM
其他研究也已探討內源性和外源性ECM來源對上皮形態發生的影響
從深層神經元產生高峰期（D40）到類似晚期皮質發生的階段（D120），類器官發育在很大程度上以相似方式進行，而不受早期外源性ECM暴露的影響。在所有條件和hPSC遺傳背景下，組織均組織為神經玫瑰花結，具有可比的背側皮質身份、由內向外的祖細胞與神經元組織結構，以及頂端-基底極性軸。神經祖細胞（NPC）首先產生CTIP2
在本研究中，我們探討了在神經上皮形成階段，使背側端腦腦類器官暴露於外源性ECM製劑Matrigel的影響。我們對類器官組織早期階段進行了詳細的形態學分析，主要聚焦於頂端-基底極性和ECM組成，但並未探究玫瑰花結組裝的確切分子機制。未來，結合對早期階段來源於鑲嵌報告PSC的類器官進行活體成像，開展對空泡化和極化過程更為詳細的生物化學表徵，以可視化組織形態發生，將是很有意義的。此外，我們選擇使用Matrigel，因為它是大腦類器官領域中外源性ECM的金標準。
然而，Matrigel含有成分未完全明確的ECM組分和生長因子混合物，這給實驗結果的解釋帶來了挑戰。事實上，儘管我們提出Matrigel來源的層粘連蛋白（Laminin）很可能參與極性建立，但我們無法精確確定在暴露培養中引起所觀察效應的具體成分。例如，在exECM中觀察到的組織圖式化效應
在類器官培養中補充外源性ECM已相當普遍，但對於某些
本研究中討論的scRNAseq數據已存入NCBI的基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，
概念構思：CMC、NSC、JS、JAK；方法學：CMC、VP、AP、PM；正式分析與研究：CMC；論文撰寫—初稿準備：CMC；論文撰寫—審閱與編輯：CMC、NSC、JS、JAK；經費取得：JAK；資源提供：JAK；監督：NSC、JS、JAK。
J.A.K. 是一項描述大腦類器官技術的專利發明人，並且是 a:head bio AG 的聯合創始人及科學顧問委員會成員。
無飼養層 hESC 細胞系 WA09（H9 ESCs）購自 WiCell；iPSCs#1 和 iPSCs#2 為本研究內部由健康供體成纖維細胞重編程獲得（內部命名分別為：iPSCs 178/4 和 iPSCs 176/1）；iPSCs#3 為購自 HipSci 的 Rozh-5 iPSCs。因此，我們使用了一種非常常見的 ESC 細胞系，以及商業可得和內部重編程獲得的 iPSC 細胞系。
所有細胞均培養於包被有 hESCs 級 Matrigel（Corning，354277）的 6 孔板（Corning，3516）上，並維持於完全 mTeSR1 培養基（StemCell Technologies，85875）中。細胞每日用 2 mL mTeSR1 換液（使用 4 mL 餵養時可每週跳過一天換液），並在匯合度達到 60–80% 時傳代（每 3–5 天一次）。傳代時，細胞暴露於用 PBS 稀釋的 0.5 mM EDTA 中（pH 7.4，不含 MgCl
背側前腦富集的端腦類器官按照先前報道的方法並稍作修改生成（
在第 10 天，成功形成超過 80% EBs 的批次被保留用於後續實驗。質量標準包括：EB 直徑大於 500 μm、形態圓整，以及出現外圍組織透明化，這表明神經上皮形成已經開始。符合這些標準的批次在 D10 被隨機分為三組，分別接受不同條件的外源性 ECM（exECM）補充。各條件的具體處理方法如下所述。
值得注意的是，在成功的批次內，所有條件下類器官質量均具有可比性，因此其質量很可能由 Matrigel 暴露之前或獨立於其作用的因素所決定，例如起始 hPSC 群體的多能性狀態、匯合度和傳代次數，以及研究人員在 EB 建立階段的操作技術。
在第 13 天，NI 培養基被更換為不含維生素 A 的分化培養基（Diff-A，
在第 20 天，所有類器官無論 Matrigel 條件如何，均轉移至 10 cm 培養皿中，並置於軌道振盪器（Celltron）上以 57 rpm 的轉速培養。在第 25 天，培養基更換為含維生素 A 的分化培養基（Diff+A，
在使用時，外源性 ECM 為 LDEV-Free Matrigel（Corning，354234）。
在 D10，EB 保持於 96 孔板中，並按照上述時間表每日更換培養基。例外情況出現在週末，此時通常會跳過一天餵養；以及在 CHIR99021 脈衝處理期間，培養基更換嚴格發生於 D13 和 D14，而非 D16。
在 D10，按照先前報道的方法，EB 被包埋於鋪設在帶凹點的封口膜片上的 Matrigel 液滴中（
在 D10，培養基（NI）中補充 Matrigel 至終濃度 2% V/V。隨後在 D13 的下一次餵養時不再加入 Matrigel。
類器官於第10、13、16、20、40和120天收集，並在室溫（RT）下用4%多聚甲醛（PFA）固定30 min（D10-D20）或1–2 h（D40-D120）。經PBS清洗3次，每次15 min後，將類器官浸入15%蔗糖（Merck Millipore，84097）/10%明膠（Sigma，G1890-500G）溶液中，於37 °C孵育，直至其沉至管底（1 h至過夜不等）。
隨後將類器官包埋於相同的蔗糖/明膠溶液中，在4 ºC下凝固30 min，並在由乾冰冷卻至−50 °C的2-甲基丁烷浴中快速冷凍。樣品儲存於−70 ºC，直至後續處理。冷凍包埋塊使用冷凍切片機（Thermo Fisher Scientific，CryoStar NX70）切製為厚度20 μm的切片。
載玻片在PBS中解凍並水化5 min後，使用封閉液〔PBS中含5%牛血清白蛋白（BSA；Europa Bioproducts，EQBAH-0500）和0.3% Triton X-100（Merck Millipore，93420）〕於RT下對冷凍切片進行透化和封閉1–2 h。抗體孵育採用抗體溶液〔PBS中含1% BSA和0.1% Triton X-100〕；抗體稀釋後，將溶液以最高轉速離心2 min。首先，將切片置於含1:200稀釋一抗的抗體溶液中，於RT孵育3.5 h（最長可至過夜）。
隨後，經PBS清洗1次，5 min後，將切片置於含1:500稀釋二抗和1:10,000稀釋Hoechst 33342核染料（Thermo Fisher Scientific，H3569）的抗體溶液中，於RT孵育1–2 h。本研究中使用的一抗和二抗彙總於
D10至D20類器官的免疫染色圖像使用正置式LSM 800共聚焦顯微鏡（Zeiss）取得。D40和D120類器官的免疫染色圖像使用Pannoramic FLASH 250 II數字切片掃描儀（3DHISTECH）取得。完整類器官的明場圖像見
使用Fiji軟件中的直線工具對明場圖像中的類器官直徑進行測量。當類器官呈現非圓形（如橢圓形）形態時，測量其最大尺寸。定量數據矩陣在R軟件v4.2.2中使用dplyr（v1.0.9）進行處理，並使用ggplot2（v3.4.0）進行可視化。為便於展示生長動態，在圖中添加了趨勢線，採用平滑條件均值函數（ggplot2::geom_smooth，formula = ‘y ~ x’）。
類器官、玫瑰花環結構和OTX2的界定
用於 scRNAseq 的類器官經收集後，使用兩個 P10 移液器吸頭切成 2 或 3 塊，並用 DPBS-/- 清洗。
每個單獨的類器官在 gentleMACS Dissociator（Miltenyi Biotec，130-093-235）中，採用 NTDK1 程序，於含有 Trypsin（Thermo Fisher Scientific，15400054）/Accutase（Sigma-Aldrich，A6964）（1:1）以及 1 μL/mL TURBO™ DNase（Thermo Fisher Scientific，AM2238，2 U/μL）的 1.5 mL 消化液中孵育。
含有解離細胞的離心管經短暫離心後，向解離細胞中加入 1.5 mL 緩衝液〔冰冷的 DPBS-/-（Thermo Fisher Scientific）和 0.1% BSA（Sigma-Aldrich）〕。細胞懸液於 4 ºC、400 g 條件下離心 5 min。吸棄上清，保留約 200 μL 餘量，並將細胞重懸於 700 μL 緩衝液中。懸液先經 70 μm 濾網過濾一次，再經 FACS 管蓋過濾兩次。
加入活性染料 DraQ7（Biostatus，DR70250，0.3 mM），終濃度為 20 μL/mL，並使用 P1000 移液器輕柔混勻懸液。採用 100 μm 噴嘴對每個單獨類器官的 250k 個活細胞進行 FACS 分選；單細胞基於前向散射和側向散射進行門控，活細胞則基於 Alexa 700 濾光片下無激發信號進行門控。
採用 10X Genomics 3’ CellPlex Kit，按照製造商方案，使用獨特的 Cell Multiplexing Oligo（CMO）對每個單獨類器官進行多重標記，但緩衝液配方以及 400 g 離心步驟採用上述條件。
多重標記後，對每個類器官的活細胞進行計數，並按相同數量混合，歸一化至活細胞數最低的類器官。最終混合樣品經離心後重懸於小體積中，並再次對活細胞進行計數。製備了兩個文庫，分別在 Chromium Single Cell 3’ B Chip（10X Genomics，PN-1000073）的每個通道中加載 40k 和 50k 個活細胞（預估每個通道回收 10k 個細胞），並通過 Chromium controller 處理以生成單細胞 GEMs（Gel Beads in Emulsion）。
scRNAseq 文庫採用 Chromium Single Cell 3’ Library & Gel Bead Kit v.3（10x Genomics，PN-1000075）製備。
兩個文庫在 NovaSeq S4 flowcell（Illumina，與其他樣本共同上機）中混合，並進行雙端測序。
scRNAseq 測序讀段使用 Cell Ranger multi v6.0.1（10X Genomics）進行處理，採用預構建的 10X GRCh38 參考基因組 refdata-gex-GRCh38-2020-A，幷包含內含子。scRNAseq 數據的進一步處理，如降維、聚類和可視化，在 R 軟件 v4.2.2 和 Seurat v4.2.0 中完成。兩個文庫之間未檢測到批次效應，因此聯合處理。
在聚類分辨率 0.1（“FindClusters”）下分離非端腦細胞。基於 FOXG1 表達缺失或低表達，去除非端腦細胞簇（簇 3、5 和 6）以進行後續分析。
在排除非端腦細胞後，我們使用 Gruffi 算法識別並去除呈現細胞應激轉錄特徵的細胞（
在分辨率 1 和 0.5 下進行聚類，基於已知標誌基因的表達，獲得了按細胞類型最可靠的分離結果：增殖中的 NPC 和 RG（分辨率 1 下的簇 3、5、7、8、12）、OPC（分辨率 1 下的簇 10）、IN（分辨率 1 下的簇 9）、IPC（分辨率 1 下的簇 4）、未成熟興奮性神經元（分辨率 1 下的簇 0、1 和 2；以及分辨率 0.5 下的簇 0 和 6）、ExNs DL（分辨率 0.5 下的簇 1）和 ExNs UL（分辨率 1 下的簇 6 和 11）。
使用統一流形近似與投影（UMAP）（uwot v0.1.14）生成二維表示。定量數據矩陣在 R 軟件 v4.2.2 中使用 dplyr（v1.0.9）進行處理，並使用 ggplot2（v3.4.0）進行可視化。
常規單因素方差分析（ANOVA）；0 ≤ p < 0.001，***；0.001 ≤ p < 0.01，**；0.01 ≤ p < 0.05，*；p ≥ 0.05，ns。Drop，exECM
常規單因素方差分析（ANOVA）；0 ≤ p < 0.001，***；0.001 ≤ p < 0.01，**；0.01 ≤ p < 0.05，*；p ≥ 0.05，ns。Drop，exECM
常規單因素方差分析（ANOVA）；0 ≤ p < 0.001，***；0.001 ≤ p < 0.01，**；0.01 ≤ p < 0.05，*；p ≥ 0.05，ns。Drop，exECM
神經誘導培養基（NI）、不含維生素 A 的分化培養基（Diff-A）以及含維生素 A 的分化培養基（Diff+A）500 mL 配方的培養基成分及配製方法。
我們感謝 Oliver Eichmüller 在分析方面提供的幫助，並感謝 Knoblich 實驗室成員對手稿提出的反饋意見。我們感謝 IMBA 幹細胞核心平台提供細胞重編程服務；IMBA/IMP/GMI BioOptics 平台提供顯微成像服務；以及 IMBA/IMP/GMI 生物資訊學平台提供測序分析。
Knoblich 實驗室的工作得到奧地利科學院、奧地利科學基金（FWF）（專項研究計劃 F7804-B 及獨立項目資助 P 35680 和 P 35369）、奧地利聯邦教育、科學與研究部、維也納市，以及歐洲研究委員會（ERC）根據歐盟“地平線 2020”計劃提供的高級資助項目（編號 695642 和 874769）的支援。
JS 獲得 EMBO 長期獎學金（EMBO ALTF 794-2018）以及歐盟“地平線 2020”研究與創新計劃項下 Marie Skłodowska-Curie 獎學金協議 841940 的資助。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.12.06.519271
🏷️ 端腦類器官 細胞外基質 神經上皮極化 形態發生 神經祖細胞