轉錄組學的突破正提供令人振奮的新方法，用於表徵生物體內細胞多樣性。
細胞是生命的基本單位。轉錄組學的進展如今使得以空前的分辨率表徵生物體內的細胞多樣性成為可能。
表徵結構多樣性的一個重要步驟，是開發諸如光片顯微鏡等先進成像方法，這些方法能夠以單細胞分辨率對整個發育中的生物體進行標準化成像。
缺乏用於比較多細胞結構的方法，尤其阻礙了對組織多樣化遺傳調控機制的研究。在細胞尺度上，形態發生主要由肌動蛋白-肌球蛋白細胞骨架驅動，並受普遍存在於所有細胞中的 RhoA GTP 酶調控。在組織尺度上，細胞骨架活動通過細胞-細胞黏附相互連接，從而協調細胞形態塑造，並生成多種器官功能所需的特定多細胞結構。這表明，細胞黏附分子，尤其是鈣黏蛋白的模式化表達，可能使組織組織方式發生受遺傳調控的改變。
長期以來，鈣黏蛋白因其在維持組織完整性中的作用而受到研究，而鈣黏蛋白表達的變化則是退行性疾病和癌症的標誌性特徵。
在本研究中，我們提出了一種量化組織多樣性的通用方法，即將組織複雜性簡化為其組成細胞的三維排列，“關注森林而非樹木”。通過對整個胚胎進行細胞核分割，我們在一個基於點雲的統一框架內定義了細胞位置。點雲是許多空間分析任務中的標準數據結構，這使得我們能夠以不依賴細胞類型的方式，對發育中組織的組織結構進行比較分析。這種粗粒化方法使我們能夠隨時間追蹤組織組織方式，並將組織特徵與基因表達相關聯。
對組織方式相似的細胞進行無偏聚類顯示，組織異質性可被歸納為兩種組織“原型”，我們依據材料科學中的標準將其命名為“非晶態”和“晶態”。界定這種
為了能夠研究整個發育中生物體的組織多樣性，我們最初聚焦於受精後 48 小時（hpf）的斑馬魚胚胎，這一階段若干主要器官的祖細胞已經形成。
a：多視角光片顯微鏡成像和細胞核分割將整體體積圖像數據轉換為點雲表示。b：對於每個細胞，多細胞組織由一個十四維特徵向量表示，該向量描述局部點分佈。需要注意的是，顯式座標並不屬於該特徵集的一部分。c：對組織特徵進行相似性聚類揭示了三類特徵：各向異性、密度和不規則性。d：組織特徵類別的空間分佈彼此不同，並突出顯示了不同的解剖區域。此外，在組織特徵空間的 t-SNE 嵌入中，各特徵類別表現出不同的分佈。
e：組織特異性的基因表達模式被映射到點雲表示上；基於標記的熒光強度（HCR、轉基因系），將單個細胞核分類為表達/不表達。f：平均組織特徵譜量化了組織多樣性。g：疊加基因表達模式的組織特徵空間 t-SNE 嵌入圖。特徵值在多個樣本的所有細胞中進行了 z 分數標準化。N：樣本數量，n：細胞總數
為了描繪整個胚胎的組織圖譜，我們使用 nuQLOUD 對主要組織的組織結構進行表徵和比較，包括皮膚、腦、肌肉和結締組織（
隨後，我們將 nuQLOUD 分析從由基因表達定義的器官擴展到斑馬魚胚胎發生多個時期的所有細胞，以識別和分析典型的組織模式。具有共同組織特徵的細胞通過高斯混合模型被歸為十一種“組織基序”（
a,b：組織多樣性隨時間增加。採用高斯混合模型（GMM）將組織特徵空間劃分為11種“組織基序”。利用四個不同發育時間點的數據可見，一些基序在早期發育過程中始終存在（如III、VI、IX），而另一些則隨時間逐漸形成（如I、II、VII）（a）。組織特徵值經z分數標準化，並對所有時間點的數據同時進行聚類。b展示了兩個組織基序的示例。基序I在早期不存在，細胞自24 hpf起開始按該基序組織，最終覆蓋中樞神經系統（CNS）；基序IX則持續定位於卵黃合胞層（YSL），並在48 hpf時還包括中位鰭褶。
特徵空間表徵（t-SNE）基於所有時間點生成。n：所示樣本中每種基序的細胞數。c-e：結構多樣性可歸納為兩種組織原型。c 基於組織結構對組織基序進行層次凝聚聚類（HAC），識別出兩種“原型”，它們映射至組織特徵空間的相對兩側，並由相反的組織特徵所定義。“無定形”原型的細胞組織呈緻密、各向同性且不規則，而“晶體狀”細胞則呈低密度、各向異性且規則排列。該聚類採用48 hpf數據。特徵值經z分數標準化。HAC採用歐氏距離和Ward連接。d,e：48 hpf時，組織原型在空間上映射為連貫區域。
CNS、感覺器官和胸鰭芽的細胞呈無定形組織，而肌肉、皮膚和YSL則呈晶體狀組織。e中表達組織特異性標記的細胞除成纖維細胞外，均歸屬於兩種原型之一。n：N=34個樣本中每種基序的平均細胞數 ± 均值的標準差。
為理解組織結構的更高層次模式，我們研究了組織基序之間的相互關係。根據組織相似性對基序進行聚類後，揭示出兩類模式，我們將其稱為組織“原型”，在48 hpf時各自約佔胚胎細胞總數的50%。基於其組織特徵譜，我們發現這兩種原型符合材料科學中“晶體狀”和“無定形”的定義（
為鑑定可能調控這種向兩種原型分化的組織二分模式的遺傳調控因子，我們考察了鈣黏蛋白家族這一細胞黏附受體家族；該家族是維持組織完整性以及基於差異黏附的細胞分選的重要調控因子。
a：在點雲表徵上對鈣黏蛋白表達域進行映射；根據標記物（HCR）的熒光強度，將單個細胞核分類為表達/不表達。選擇在全部細胞中表達比例超過1%的鈣黏蛋白（補充圖10a）。b：特異性鈣黏蛋白表達域佔據組織特徵空間中的不同區域。各表達域要麼定位於左半球，要麼定位於右半球。c：基於組織特徵的聚類揭示了兩類鈣黏蛋白表達細胞。表達域的平均特徵值經過z評分標準化。d：這兩類鈣黏蛋白映射到特徵空間中彼此離散的兩半，並且分別主要包含於無定形和晶體型原型之中。e：這兩類鈣黏蛋白映射到組織原型。
尺度：與原型相關聯的細胞百分比；青色/橙色表示100%關聯，白色表示各佔50%。f：基於單細胞RNA測序數據，對鈣黏蛋白表達域進行自相關聚類。
為進一步研究鈣黏蛋白表達與組織原型之間的聯繫，我們對鈣黏蛋白表達域的組織結構進行了動態分析。我們的推理是，如果鈣黏蛋白調控組織結構，那麼它們應當隨時間維持其組織特徵譜。因此，我們選擇E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白（cdh1、cdh2，E-/N-Cad）作為分別代表無定形和晶體型組織化鈣黏蛋白類別的代表，並利用轉基因報告系統追蹤其表達模式（TgCRISPR(cdh1-mLanYFP)
a、b：E-cad 和 N-cad 的表達模式在定性上分別與晶態和非晶態原型相吻合。灰點：不表達細胞；未顯示雙陽性細胞。c：在整個早期發育過程中，cdh1/2 與晶態/非晶態組織方式的關聯始終得以維持。N=4 個樣本/時間點。每個時間點非晶態與晶態群體的 P 值：< 1.02×10^-5（cdh1），< 3.00×10^-4（cdh2）；Welch t 檢驗。d：肌肉以前後（A-P）方式下調 N-cadherin 的表達。
箭頭：代表性圖像的位置，顯示 N-cadherin 的下調及組織方式的變化。虛線：12 hpf 時的肌肉祖細胞；星號：脊索，用於方位參照。線圖：沿 A-P 軸表達 cadherin 的細胞數量。12 hpf：背側視圖；24、48 hpf：矢狀視圖。各時間點之間縱軸未作歸一化。e：組織原型以沿前後軸的方式發生轉換。t-SNE 和 A-P 線圖顯示了發育過程中肌肉細胞的組織轉變。f：晶態肌肉細胞已下調 N-cadherin，而在轉換過程中，N-cadherin 陽性細胞呈非晶態組織。
g：發育中的肌肉在轉換組織原型時，各向同性降低，密度也降低。h-i：N-cadherin 敲除（KO）在 24 hpf 時誘導晶態組織增加，並導致 A-P 模式喪失。通過 F1 代中 CRISPR/Cas9 介導的 N-cadherin 瞬時敲除實現。h：代表性圖像展示了 N-cadherin KO 對組織方式的影響，線圖顯示 A-P 原型轉換的喪失。i：與 WT 對照相比，KO 組在 12 和 48 hpf 時有顯著更多細胞呈晶態組織（Welch t 檢驗）。
j：N-cadherin 缺陷細胞的組織密度與 WT 在 48 hpf 時的肌肉相似，但表現出更高異質性的各向同性特徵。所有比例尺均為 100 µm。A-P 線圖中的實線表示平均細胞數，較細的線表示各個樣本的分佈曲線。
12 hpf 時的細胞，此後從 48 hpf 起逐漸集中於中樞神經系統（CNS）細胞及其他部分組織的一個子集（
為更詳細地檢驗這一點，我們隨後在單一組織內研究了這種關係，重點關注 12 至 48 hpf 期間發育中的快縮肌。這是一個研究較為深入的形態發生系統，表現出動態變化的 cadherin 表達：早期 N-cad 呈均一表達，隨後則侷限於表層慢肌細胞。
N-cad表達下調能夠使組織從無定形組織過渡到更具晶體樣的組織，這一發現預示着，諸如中樞神經系統（CNS）等持續高水平表達N-cad的組織，可能需要這種持續表達來維持其無定形原型。為檢驗這一假設，我們將對N-cad敲除（KO）的分析擴展至12至48 hpf的整胚胎，起始於N-cad剛達到其完全表達的發育階段（補充圖15a）。在12 hpf時，表現出無定形組織的細胞比例顯著下降，而晶體樣組織增加（
a-c：N-cadherin敲除降低了12 hpf時無定形組織的頻率。a：未注射（對照）與N-cadherin KO胚胎的代表性重建圖；12 hpf，細胞核經分割並按原型着色。KO通過在胚胎發育1細胞期注射Cas9 + 針對N-cadherin的sgRNA實現。與對照相比，KO中無定形組織的細胞比例下降約30%（b），而兩種條件下的細胞數量無顯著變化（c）。d：N-cadherin的嵌合敲除（mKO）通過在胚胎發育8細胞期向單個細胞注射Cas9 + sgRNA實現。
通過組合標記鑑定被操作的細胞：在WT條件下，CNS細胞共表達NBT和N-cadherin；mKO細胞丟失N-cadherin，僅表達NBT。e：mKO效率較高，使NBT+細胞中N-cadherin+細胞的比例從約98%降至約34%。f：全腦光片顯微鏡證實了形態學表型，並提示mKO克隆中的組織結構發生改變。比例尺：概覽圖200 µm，放大圖15 µm。g：將NBT+細胞投影到組織特徵空間表徵中，顯示僅在N-cadherin mKO細胞中出現向晶體樣組織的原型性偏移。
對每個樣本中分割得到的細胞核組織進行定量，隨後與整體組織特徵空間進行對齊。N：樣本數，n：分析細胞總數。h：與N-cad+細胞相比，N-cad mKO細胞中晶體樣組織的細胞比例顯著增加；後者的組織方式與對照胚胎中的N-cad+細胞相比無顯著差異。i：向晶體樣組織的偏移由細胞密度降低和規則性增加所驅動。所示p值通過Welch t檢驗計算。
光學顯微技術和轉錄組學的進展，已使從類器官到各種實驗系統中組織異質性的研究興趣激增
nuQLOUD方法的目標之一，是提供一種在整個有機體尺度上定義組織組織方式的新方法。諸如上皮-間充質範式這類關於組織狀態的通用描述極具威力，因為它們能夠在多種生物學語境之間實現概念和機制的遷移
nuQLOUD 提供的組織構型定量讀出使我們能夠探索鈣黏蛋白表達與組織構型原型之間的關係。將 12 種主要鈣黏蛋白的空間表達數據整合到 nuQLOUD 框架中後，揭示出兩個不同的群組：與晶態組織相關的鈣黏蛋白，如 E-cad；以及與非晶態組織相關的鈣黏蛋白，包括 N-cad。時間分辨分析表明，N-cad 表達與非晶態原型高度相關：在早期階段，大多數細胞表達 N-cad，隨後隨着細胞經歷由非晶態向晶態的轉變，N-cad 被更具組織特異性的鈣黏蛋白所取代。
相比之下，神經系統細胞在所研究的所有階段均表現出高水平的 N-cad 表達和非晶態原型組織特徵，這與其在神經發育中的既有作用一致。無論是通過正常發育過程中的下調，還是通過靶向擾動導致的 N-cad 缺失，都會使細胞的組織構型由非晶態切換為晶態，從而確定 N-cad 是非晶態原型的核心調控因子。這些數據支援這樣一種模型：N-cad 的下調以及脱離非晶態原型，代表了一種調控非神經組織組裝的共同門控機制。有趣的是，近期研究表明，N-cad 功能失活會提高體外培養的哺乳動物原腸胚樣體的自組織潛能。
當前的 nuQLOUD 框架並非沒有侷限性。首先，它假定在某一特徵長度尺度上存在連續排列，通常為 Delaunay 圖上的一個最近鄰。儘管這一假設適用於分析尺寸超過約 30 µm 的組織，但對於狹窄結構，如血管，則並非最優。
斑馬魚（Danio rerio）品系按照標準程序進行維持、飼養和繁殖，具體方法見
自受精後 24 小時（hpf）起，胚胎以 0.002% N-苯基硫脲（PTU，Sigma-Aldrich）處理以防止色素形成。為在篩選過程中固定 24 hpf 以上的胚胎，對其使用 0.01% 甲磺酸三卡因（MS222，Sigma-Aldrich）處理。此外，在固定前使用高濃度三卡因（300 mg/L）對胚胎實施安樂死。為輔助並加速 24 至 48 hpf 胚胎的脱膜處理，使用 0.05% 鏈黴蛋白酶進行處理。
為在活體且無需染色的條件下可視化基因表達，使用了轉基因斑馬魚品系。神經系統採用 Tg(NBT:DsRed) 進行可視化。
在成像之前，對於48 hpf之前階段的斑馬魚胚胎，使用Dumont #5鑷子手動去除卵膜；更晚時間點的胚胎則已自行孵化。胚胎採用tricaine安樂死，並在室溫下置於1X磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中的4%多聚甲醛（PFA）中固定1小時。
隨後，樣品用PBS Tween（PBS + 0.05% Tween-20，Thermo Fisher Scientific，PBS-T）沖洗3次，在PBS Triton（PBS + 0.1% Triton X-100，Thermo Fisher Scientific）中通透處理1小時，並再次用PBS-T沖洗。樣品的細胞核通過在室溫下用1X 4′,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）處理2小時進行染色。
染色後，樣品用PBS-T沖洗，儲存在4°C的PBS-T中，並在14天內完成成像。
為了鑑定表達目標基因的細胞，我們採用雜交鏈式反應RNA熒光原位雜交（HCR RNA FISH）對其轉錄本進行標記。
F0敲除通過將sgRNA/Cas9混合物注射到早期階段斑馬魚胚胎中生成。sgRNA序列總結見（補充表2）。注射混合物由Cas9-2xNLS蛋白（1 mg/µL）、sgRNA（128 ng/µL）和酚紅（0.025%）組成。完全敲除通過在胚胎發育1細胞期向卵黃中注射1–2 nL注射混合物實現；嵌合敲除（mKO）則通過在發育8細胞期向其中一個細胞注射實現（25°C下受精後約1小時10分鐘）。
Cas9蛋白購自歐洲分子生物學實驗室（EMBL）蛋白表達與純化核心設施，並以含有Hepes、KCl和甘油的培養基在-80°C保存。
為了驗證sgRNA的有效性，對所用sgRNA同源區域進行擴增和測序，以檢測DNA序列多態性。為此，將注射後的胚胎培養至4 dpf，並使用tricane安樂死。使用40 µL QuickExtract DNA提取液（Lucigen QE0905T）從單個樣品中提取基因組DNA。胚胎分別在25°C孵育15分鐘、65°C孵育5分鐘和95°C孵育2分鐘，並在各孵育步驟之間進行渦旋振盪。隨後，以13,000 rcf離心1分鐘去除固體碎屑。
為了擴增sgRNA同源區域，使用軟件工具Primer3設計側翼引物對。
樣品通過使用Transferpettor活塞桿（BRAND，Merck）將其頭部朝前吸入20 µL玻璃毛細管（BRAND Transferpettor caps，Merck）中，幷包埋於1X E3魚胚培養液中的1%低熔點瓊脂糖溶液內。
光片顯微成像在Zeiss Z.1 Lightsheet顯微鏡上進行。所有圖像均使用Zeiss W Plan Apochromat 20×1.0校正型水浸物鏡和一對Zeiss 10×照明顯微物鏡採集。對於
對於整胚採集，樣本從四個相互正交的方向進行成像，首先採用側視圖，此時樣本的腹背軸自左向右延伸；隨後沿樣本的前後軸按順時針方向每次旋轉90°繼續成像。對於12 hpf樣本，一個這樣的成像體積即可足以捕獲整個樣本。對於發育程度更高的樣本，則沿樣本的前後軸採集多個彼此重疊（10%–20%）的四視角成像體積；24 hpf：2個體積，48 hpf：4個體積，72 hpf：5個體積。連續幀之間的z軸間距為1 µm，且對於每一幀，左側和右側光片照明分別記錄。採集過程見補充圖1。
採集過程中，開啟了“Pivot Scan”選項以減少照明偽影。通過對比度最大化，對每個樣本分別手動校準光片偏移。照明設置的選擇以儘量縮短採集時間為原則。為避免在設置過程中發生光漂白，空間配準和多視角設置使用DAPI通道完成。其他熒光通道則通過單幀採集進行設置。多色成像按順序進行，並優先於顏色的是z-stack，即以單一顏色重複採集完整的z-stack。因此，整個成像過程可概括為：光片方向 → z-stack → 顏色 → 體積 → 平鋪塊。
原始光片圖像以czi（Zeiss）文件格式存儲。MVRegFus軟件包（可取得於
使用Tracking with Gaussian Mixture Models（TGMM 2.0）軟件，從體積顯微圖像中對單個細胞核進行三維分割
使用軟件voro++的修改版本生成三維Voronoi圖
早期斑馬魚發育的單細胞RNA測序數據取得自
除非另有說明，統計顯著性採用非參數檢驗進行檢測。對於非配對樣本，採用Mann-Whitney U檢驗；對於配對樣本，採用Wilcoxon符號秩檢驗。除非另有說明，N表示樣本數（重複數），n表示細胞數（觀測數）。在統計分析中，觀測值按樣本分組。
箱線圖通過顯示其中位數（中心線）、四分位距（箱體）、1.5倍四分位距（須）以及離群值（異常點）來展示數據分佈。除非另有說明，柱狀圖中的誤差線表示均值的標準差。
對於低維嵌入，使用了t-SNE或UMAP。t-SNE表徵按照
支援本研究結論的所有數據均可在本文及其補充文件中取得，或可在合理請求下向通訊作者獲得。所有原始光片數據（多視角融合後）均可在BioImage Archive中取得（
MB 和 DG 構思了該項目並設計了實驗。MB 完成了所有實驗，進行了光片顯微成像、圖像分析、nuQLOUD 軟件開發以及數據分析。MA 開發了多視角融合軟件。MB 和 JJ 實施了 F0 CRISPR 基因敲除。RB 提供了轉基因斑馬魚品系並優化了 HCR 染色。MB 和 DG 對數據進行了解釋，並在所有作者的意見基礎上撰寫了手稿。
感謝 Francesca Peri 及其實驗室、François Nédélec、Damian Brunner、Jana Wittmann 以及 Gilmour 實驗室全體成員的討論。感謝 Cornelia Henkel 負責魚類飼養。感謝蘇黎世大學顯微與圖像分析中心的 Urs Ziegler、Jana Döhner 和 Joana Delgado Martins 在圖像採集與分析方面提供的支援及基礎設施。感謝 Kim Remans 和歐洲分子生物學實驗室蛋白表達與純化核心設施提供 Cas9。
感謝 Mark Cronan 和 David Tobin 提供 E-Cad 報告品系。感謝 DG 獲得的 SNSF 176235 號資助以及 MB 獲得的蘇黎世大學 Forschungskredit FK-21-084 號資助。
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🏷️ 胚胎發育 組織多樣性 細胞排列 鈣黏蛋白 三維成像 形態發生