人類胚胎在植入子宮後會經歷形態發生轉變，然而，由於無法觀察胚胎，這一關鍵階段的認知仍然有限。
人類生殖的效率顯著偏低，據估計，約有60%的妊娠在受精後的前兩週內失敗。
近期在小鼠胚胎中的研究建立了適用於人類胚胎的條件。
已開發出多種方案，可從人胚胎幹細胞（hESCs）中誘導獲得滋養層細胞和下胚層細胞。
我們表明，由誘導的胚外樣譜系與野生型hESC聚集形成的細胞團塊，能夠自組織為類胚胎結構，模擬植入後發育的若干關鍵特徵，包括腔形成、羊膜形成、原始生殖細胞形成以及前部下胚層的特化。重要的是，這些可誘導的人類類胚體具有模組化特徵，不依賴外源性信號因子，並且便於進行遺傳擾動。
通過表達Gata4或Cdx2，小鼠胚胎幹細胞（ESCs）可分別被誘導生成胚外內胚層或滋養層，這些細胞能夠在三維類胚體模型中模擬發育過程。
（A）誘導型GATA6（iG6）和/或SOX17（iS17）人胚胎幹細胞（hESCs）的構建，以及在基礎N2B27培養基中加入強力黴素24小時後的驗證。N=3次獨立實驗，包括551個iG6細胞、550個iS17細胞和707個G6-S17細胞。（B）誘導型GATA3（iG3）和/或AP2γ（iAP2γ）人胚胎幹細胞（hESCs）的構建，以及在基礎N2B27培養基中加入強力黴素24小時後的驗證。N=3次獨立實驗，包括1456個iG3細胞、409個iAP2γ細胞和782個iG3-AP2γ細胞。
（C）對經3天強力黴素誘導後的測序野生型（RSeT WT）、誘導型GATA6-SOX17（第3天 iG6-S17）和誘導型GATA3-AP2γ（第3天 iG3-AP2γ）RSeT hESCs進行基於統一流形近似與投影（UMAP）的降維可視化。（D）Logistic迴歸分析及細胞與人類植入後胚胎細胞群的比較。細胞係數據投射到Molè等人（2021）的人類胚胎數據上。
（E）經3天強力黴素誘導後的野生型、誘導型GATA6-SOX17和誘導型GATA3-AP2γ RSeT hESCs的RNA測序篩選差異表達基因（藍色；左）以及由ATAC測序預測並通過chromVAR評分的差異基序可及性（粉色；右）。（F）野生型、誘導型GATA6-SOX17和誘導型GATA3-AP2γ RSeT hESCs在二維共培養條件下的驗證。
為了評估所篩選候選轉錄因子將 hESCs 程序化為類胚外細胞身份的能力，我們在處於從 naïve 到 primed 多能性譜系不同狀態的細胞中，分別單獨或聯合過表達這些轉錄因子。我們採用了三種已建立的起始培養條件：PXGL，用於支援植入前樣 naïve hESCs；RSeT，用於產生處於中間圍植入期樣多能狀態的 hESCs；以及常規 mTeSR1 條件，用於維持植入後樣 primed hESCs。
在基礎 N2B27 培養基中進行三天轉錄因子過表達後，我們觀察到，無論使用單個還是聯合轉基因，且無論起始於何種多能狀態，在蛋白質和 mRNA 水平均出現了胚外基因誘導的顯著差異（
在驅動類滋養層細胞形成時，AP2γ 轉基因在上調 GATA2 和 CK7 表達方面似乎尤其有效。然而，單獨誘導 AP2γ 會導致 primed 細胞發生死亡並喪失轉基因表達，而在 RSeT 或 PXGL 細胞中則未出現這種情況（
我們推測，RSeT hESCs 是生成我們幹細胞來源的人植入後胚胎模型的最佳起始細胞類型，因為它們：（1）代表發育的圍植入期階段
為了進一步表徵誘導表達 GATA6-SOX17 或 GATA3-AP2γ 的 RSeT hESCs，我們進行了單細胞 10x multiome 測序，並同時評估了轉錄組和染色質可及性。當使用統一流形近似與投影（UMAP）對這些單細胞數據進行可視化時，細胞根據細胞類型發生聚類（
由於這三種來源於 RSeT hESC 的細胞類型——野生型、GATA6-SOX17 誘導型和 GATA3-AP2γ 誘導型——均可在 N2B27 培養基中共培養，我們首先用強力黴素誘導所選轉錄因子的表達 3 天，以生成類下胚層和類滋養層細胞，隨後在 Aggrewell 培養皿中對細胞混合物進行聚集（
(A) 通過將野生型 RSeT hESC 與可誘導的胚外樣細胞結合，生成人可誘導胚樣體的實驗方案概述。為生成下胚層樣細胞，使用了可誘導 GATA6-SOX17（iG6-S17）。為生成滋養層樣細胞，使用了可誘導 GATA3-AP2γ（iG3-AP2γ）。胚外樣細胞在第 0 天聚集前誘導 3 天。(B) 聚集後第 1 天至第 3 天細胞聚集體的大小。N=5 次獨立實驗，其中第 1 天結構 175 個、第 2 天結構 171 個、第 3 天結構 91 個。
(C) 聚集後 96 小時，結構表現出清晰的自組織，其內部為 SOX2 陽性區域，周圍依次被 GATA6 陽性和 GATA3 陽性胚外樣細胞群層包圍。(D) 可誘導人胚樣體在內部 SOX2 陽性區域內表現出明確的頂-底極性，包括 PODXL 陽性腔形成，以及 SOX2 陽性上胚層樣區室與下胚層樣區室之間基底側 laminin 的沉積。(E) 可誘導人胚樣體形成效率及其組織化程度的定量。
N=5 次獨立實驗，共 952 個用於三譜系分析的結構；N=3 次獨立實驗，共 506 個用於腔形成和 ECM 效率分析的結構。(F) 不同起始多能性狀態下可誘導人胚樣體形成的定量。N=5 次獨立實驗，共定量分析 1189 個結構。(G) 下胚層樣區域表達 N-Cadherin 和 SOX17。來源於可誘導 GATA3-AP2γ 的細胞（表達 GFP）顯示出明確的外側定位。
(H) 體外培養的人胚胎在受精後第 9 天的代表性圖像，顯示出清晰的腔化 SOX2 區域，周圍包繞一層 GATA6 陽性細胞。其中一部分 GATA6 陽性細胞表達前部下胚層標誌物 CER1。比例尺 = 100 mm。統計學方法：（F）採用單因素方差分析（one-way ANOVA）並結合 Dunnett 多重比較檢驗。*p<0.05。
我們以 1:1:2 的比例鋪板野生型:GATA6-SOX17-可誘導:GATA3-AP2γ-可誘導細胞，細胞數為 3.6 × 10
我們的可誘導人胚樣體還以有序方式表達了其他若干譜系標誌物，包括推定下胚層樣區室中的 N-Cadherin 和 SOX17，以及推定滋養層樣細胞外層中的 CDX2（
為深入了解我們的人胚模型是否形成了與天然人胚胎一致的基因表達和染色質可及性模式，我們對聚集後第 4、6 和 8 天的人胚模型進行了單細胞多組學 RNA 和 ATAC 測序。
（A）誘導型人類胚樣體的延長培養方案示意圖，以及使用 10x 平台進行單細胞 RNA 測序和單細胞 ATAC 測序聯合採樣的流程。（B）基於利用 scmap 結合 RNA 速度與染色質速度，對多個人人類及非人靈長類胚胎數據集進行轉錄投射，對細胞進行了註釋。（C）各細胞簇中 RNA 測序數據中篩選出的差異表達基因（上，藍色）以及在 ATAC 測序數據中由 chromVAR 評分預測的差異可及基序（下，粉色）。
（D）誘導型人類胚樣體在第 6 天下調 SOX2，並上調 CDX2、ISL1，在第 8 天上調 VTCN1，提示發生了穩健的羊膜分化與成熟。（E）原始生殖細胞標誌基因的模組評分（Jo 等，2021）。（F）各細胞簇中所選原始生殖細胞基因的熱圖。（G）通過免疫熒光鑑定誘導型人類胚樣體中 SOX17/NANOG/AP2γ 三陽性的類原始生殖細胞，箭頭所示。（H）第 4 天（n=10 個胚樣體）和第 6 天（n=10 個胚樣體）SOX17/NANOG/AP2γ 三陽性（+）細胞的定量。
N=2 次獨立實驗。比例尺 = 100 µm。
近期研究提出，羊膜和原始生殖細胞（即配子的前體）至少部分來源於一種雙能祖細胞。
一般認為，在靈長類胚胎中，羊膜和胚外間充質的產生是對 BMP 信號響應的結果。
為進一步理解我們的人類胚胎模型中潛在的組織間串擾，我們使用了計算工具 CellPhoneDB。
為驗證 BMP 信號在該胚胎模型內部區域分化過程中是否發揮活性作用，我們檢測了磷酸化（p）SMAD1.5 的表達。聚集後第 4 天和第 6 天，在 OCT4 陽性的類上胚層區域中觀察到 pSMAD1.5 富集，提示 BMP 信號處於活躍狀態（
BMP 信號通過前部下胚層的拮抗作用被限制於胚胎後部；前部下胚層分泌 BMP、WNT 和 NODAL 的抑制因子，包括 CER1 和 LEFTY1。
綜合來看，這些數據凸顯了下胚層細胞亞群分化所依賴的基因調控網絡在功能上的差異：持續且高水平的 SOX17 表達會拮抗前部下胚層身份，轉而促進 CER1 陰性的下胚層身份。因此，通過調控誘導型人類胚樣體中的類下胚層細胞，我們揭示了類上胚層區域上調原條標誌物的能力，表明這一模組化胚胎模型在研究胚內與胚外組織相互作用方面具有重要價值。
在此，我們構建了一種由多譜系幹細胞衍生的人類著床後胚胎模型，該模型在其類上胚層結構域中經歷腔形成，併發生反映類胚外組織與類胚胎組織之間相互作用的分化事件。我們的人類胚胎模型在BMP信號作用下形成類羊膜細胞，這些細胞沿着靈長類之間保守的發育軌跡逐步成熟，從AP2α陽性轉變為ISL1和CDX2陽性，最終成為VTCN1陽性的羊膜細胞。
我們表明，調節用於驅動類下胚層細胞誘導的轉錄因子組合，會使下胚層貢獻的平衡從CER1陰性的類下胚層細胞（GATA6-SOX17誘導）轉向CER1陽性的前部類下胚層細胞（僅GATA6誘導）。聚集後第4天前部類下胚層樣細胞的存在似乎能夠在更長時間內保護類上胚層結構域的多能性，從而使其在發育上更晚的階段退出多能狀態。該結果與聚集後第6天原條標誌物BRY/TBXT表達升高的現象一致。
這些結果表明，RSeT hESCs隨時間推移在該胚胎模型中獲得了分化為類原條細胞的能力，這與其他naïve hESC的報道一致。
在本研究中，我們通過驅動特定轉錄因子的表達，由多能性hESCs生成了兩種胚外細胞類型，並將其與親本hESC細胞繫結合，構建了一個著床後人類胚胎模型。通過轉錄因子介導誘導胚外細胞的方法，也已被用於構建著床後幹細胞衍生的小鼠胚胎模型。
總之，我們提出了一個模組化、易於操控的人類著床後發育模型，關鍵在於其同時包含類胚胎細胞和類胚外細胞。這是一個著床後模型，因此不具備發育形成可存活人類胚胎的能力，因為其不能植入。這些可誘導的人類胚樣體並不模擬原條形成之後的發育階段，也不包含原腸胚階段胚胎的全部細胞類型。
人胚胎幹細胞（Shef6）的相關研究在英國人類幹細胞庫指導委員會批准下開展，批准編號為 SCSC21-38，並遵循《英國人類幹細胞系使用實踐規範》的相關規定。人類胚胎研究受人類受精與胚胎學管理局（HFEA）監管，並在許可證 R0193 下開展。倫理批准由劍橋大學人類生物學研究倫理委員會獲得（參考編號 HBREC.2021.26）。
CARE Fertility、Bourn Hall Fertility 和 Herts & Essex Fertility Clinics 的 IVF 患者在治療結束時獲得了針對本項目的相關資訊。所有患者均獲提供諮詢服務，未獲得任何經濟利益，並可在胚胎用於研究之前的任何時間撤回參與。胚胎培養未超過受精後 14 天，亦未超過原條首次出現的時間點。
Shef6 人胚胎幹細胞在 Matrigel 包被培養板上於 mTESR 培養基（05825，STEMCELL Technologies）中培養，培養條件為 37°C、20% O2、5% CO2。培養板以溶解於 DMEM/F12（21331-020，Life Technologies）中的 1.6% 低生長因子 Matrigel（356230，BD Biosciences）於 37°C 包被 1 小時。
hESCs 採用 TrypLE（12604013，ThermoFisher Scientific）進行傳代。傳代後最初 24 小時內加入 10 µM ROCK 抑制劑 Y-27632（72304，STEMCELL Technologies）。培養基每 24 小時更換一次。細胞常規採用 PCR（6601，Takara Bio）檢測支原體污染。為將 primed 狀態 hESCs 轉換為 RSeT 或 PXGL 培養條件，細胞被傳代至經絲裂黴素 C 失活的 CF-1 MEFs（3×10
為構建 Piggyback 質粒，按照製造商說明，使用 Phusion 高保真 DNA 聚合酶（M0530S，New England BioLabs）以帶有 AttB 末端延伸序列的人細胞系 cDNA 為模板擴增全長編碼序列。擴增產物按照製造商說明，使用 BP clonase（11789100，ThermoFisher Scientific）導入 pDONR221 入門質粒，隨後再使用 LR clonase（11791020，ThermoFisher Scientific）導入目標質粒。
採用 Neon 轉染系統並使用以下參數對 hESCs 進行電轉：1200 V，2 ms，2 個脈衝。
電轉質粒包括 GATA6-3XFLAG-TetOn-Zeo（入門質粒 72922，Addgene）和/或 SOX17-TetOn-Hygro 或 GATA3-EGFP-TetO-Hygro（Dr. Mika Drukker 惠贈）和/或 TFAP2C-TetOn-G418，此外還包括 PB-CAG-rTTA3-Bsd 或 PB-CAG-rTTA3-Zeo，以及表達 PiggyBac 轉座酶的 pBase 質粒。
轉染兩天後，以 1/4 劑量加入抗生素，並逐步增加至終濃度：100 µg/mL zeocin（ant-zn-1，Invitrogen）、20 µg/mL blasticidin（A113903，ThermoFisher Scientific）、50 µg/mL G418（10131035，ThermoFisher Scientific）或 50 µg/mL Hygromycin B（10687010，ThermoFisher Scientific）。克隆通過在體視顯微鏡下手動挑取單個菌落獲得。
通過加入 1 µg/mL 鹽酸多西環素（doxycycline hyclate，D9891，Sigma）誘導轉基因啟用。需要注意的是，AP2γ 誘導型細胞在 PXGL naïve 條件下未能重置。
收集細胞沉澱後，按照製造商說明使用 Qiagen RNeasy 試劑盒提取 RNA。使用 1 µg RNA 進行逆轉錄反應，所用試劑包括隨機引物（C1181，Promega）、dNTPs（N0447S，New England BioLabs）、RNA 酶抑制劑（M0314L，New England BioLabs）以及 M-MuLV 逆轉錄酶（M0253L，New England BioLabs）。
RT-qPCR 使用 Power SYBR Green PCR Master Mix（4368708，ThermoFisher Scientific）在 Step One Plus 即時 PCR 儀（Applied Biosystems）上進行。程序設置如下：95°C 10 分鐘，隨後進行 40 個循環，每個循環包括 95°C 15 秒和 60°C 1 分鐘。本研究中所使用的所有引物均觀察到單一熔解曲線。
為構建植入後胚胎的三維幹細胞來源模型，將轉換至 RSeT 培養基後傳代 2 至 6 次的 RSeT 細胞按常規進行傳代；次日（第 -3 天），胚外樣細胞（誘導 GATA6、誘導 GATA6-SOX17 或誘導 GATA3-AP2γ）的培養基更換為含 5% Knockout Serum Replacement 和 1µg/mL DOX 的 N2B27。該培養基每 24 小時更換一次，持續 3 天。
第 0 天（聚集當天），通過預包被抗黏附溶液（07010, STEMCELL Technologies）並以 2000g 離心 5 分鐘來製備 Aggrewell 培養皿（34415, STEMCELL Technologies）。在加入實驗培養基前，用 PBS 清洗孔兩次。該培養基由含 5% knockout serum replacement、1µg/mL doxycycline 和 10µM Y-27632 的 N2B27 組成。
向用於誘導人胚樣體生成的含細胞孔中加入 10µM Y-27632 後 1 小時，對誘導細胞和野生型 ESC 進行酶解離。解離後的細胞經沉澱後重懸於實驗培養基中，並置於明膠包被孔中以去除 MEF。15–30 分鐘後，對細胞進行計數、混合，並接種至 Aggrewell 培養皿中，最終按每個 Aggrewell 微孔接種 8 個野生型 ESC、8 個下胚層樣細胞和 16 個滋養層樣細胞進行計算。
第 1 天，將培養基進行兩次、每次更換三分之二，更換為含 5% knockout serum replacement 和 1µg/mL doxycycline 的 N2B27。第 2 天，對 Aggrewell 進行半量換液，換為含 1.25 µg/mL hIGF1（78022.1 STEMCELL Technologies）和 1µg/mL doxycycline 的 hIVC1 培養基。
hIVC1 培養基由 Advanced DMEM/F12（12634-010 ThermoFisher Scientific）補充 20% 滅活 FBS（10270106, ThermoFisher Scientific）、1x Glutamax、1X NEAA、1x Essential AA、1x ITS-X、25U/mL Pen/Strep、1.8mM 葡萄糖（G8644, Sigma-Aldrich）、0.22% 乳酸鈉（L7900, Sigma-Aldrich）、8nM β-雌二醇（50-28-2, Tocris）和 200ng/mL 孕酮（P0130, Sigma-Aldrich）組成。
自第 3 天起，每天均使用該培養基進行半量換液。第 4 天，在體視顯微鏡下使用口吸管手動挑取聚集體，轉移至超低吸附 96 孔板（CLS7007, Corning）的單個孔中，並在上述含 IGF1 和 doxycycline 的 hIVC1 培養基中繼續培養。
樣本用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）清洗後，於室溫下用 4% 多聚甲醛（PFA；1710, Electron Microscopy Sciences）固定 20 分鐘。隨後用 PBS + 0.1%（vol/vol）Tween-20（PBST）清洗樣本 3 次，並在室溫下於 PBS 中用 0.3%（vol/vol）Triton X-100（T8787, Sigma Aldrich）+ 0.1mM 甘氨酸（BP381-1, Thermofisher Scientific）孵育 30 分鐘。
樣本隨後在封閉液中封閉（PBST 含 5%（w/vol）BSA，A9418, Sigma），之後在 4°C 下用封閉液稀釋的一抗孵育過夜。見
人胚胎按先前描述的方法復甦並培養
統計分析使用 GraphPad Prism 9 進行。樣本量未預先確定，且作者在實驗條件方面未實施盲法。所有實驗均至少獨立重複兩次。在圖中，所有數據均以均值 ± SEM 表示。
為收集用於單細胞測序的著床後胚胎模型，在第 4、6 和 8 天通過目視挑選組織結構正確的 embryoid，並在 4 孔板中用 PBS 清洗兩次後轉移至 TrypLE 中。樣本每 5 分鐘通過吹打混勻一次，持續 10–20 分鐘直至解離。隨後通過加入 2 倍體積、含 20% FBS 的 PBS 終止酶活性。將細胞收集至 Falcon 管中，離心沉澱後重懸於凍存緩衝液中。
該緩衝液由以下成分組成：50 mM Tris（pH 8.0；15-567-027，Fisher Scientific）、25% 甘油（G5516，Sigma-Aldrich）、5 mM Mg(OAc)2（63052，Sigma-Aldrich）、0.1 mM EDTA（15575020，ThermoFisher Scientific）、5 mM DTT（R0861，ThermoFisher Scientific）、1× 蛋白酶抑制劑混合物（P8340，Sigma-Aldrich）以及 1:2500 稀釋的 superasin（AM2694，Invitrogen）。
對於細胞系，計數 10,000 個細胞後離心沉澱，並重懸於上述凍存培養基中，隨後於 -80°C 緩慢凍存。
對於細胞核分離和文庫構建，採用了 10x Genomics 的低輸入細胞核分離方案。簡而言之，將凍存細胞沉澱在 37°C 水浴中復溫 30 秒，隨後離心（4°C，500g，5 分鐘）使細胞沉澱，再吸除上清液。細胞沉澱用 200 µl 含 0.04% BSA 的 1× PBS 清洗兩次，每次清洗之間均進行離心並吸除上清。隨後，向清洗後的細胞沉澱中加入預冷裂解緩衝液（每個樣本 45 µl），置於冰上 3 分鐘，然後加入洗滌緩衝液（每個樣本 50 µl）。洗滌後的分離細胞核重懸於稀釋的細胞核緩衝液中。
在本研究中，分離的細胞核重懸於 5 µl 稀釋細胞核緩衝液中，並直接加入轉座反應。在後續所有步驟中，均按照製造商的規範和指南，遵循 10x Genomics Single Cell Multiome ATAC and Gene Expression 方案。
最終文庫加載至 NextSeq 2000 平台，使用 P2 100 cycle 試劑盒，加載濃度為 650 pM，採用雙端測序，並遵循 10x Genomics 推薦的測序讀長設置（基因表達文庫為 28/10/10/90 cycles，ATAC 文庫為 50/8/24/49 cycles）。
原始讀段使用 CellRanger ARC 流程進行分析，以為每個樣本生成 ATAC 和 RNA 的 fastq 文件，並進一步比對基因組和轉錄組讀段。隨後將矩陣讀入 Seurat。
我們採用了近期發表的一種用於 velocity 計算的方法，該方法同時考慮單細胞 ATAC 和 RNA 數據。
使用 CellPhoneDB 2.0 的預設設置評估潛在的組織信號傳導串擾。
Yan 等人、Blakely 等人、Petropolous 等人、Zhou 等人和 Xiang 等人此前發表的數據，使用 kallisto 或 kb-bustools 重新比對至 hg38 人類基因組。
本研究產生的數據可在 Gene Expression Omnibus 中取得，登入號為 GSE218314。為便於審稿，可使用令牌 ijkhciquzhubbqt 訪問該數據集。
此前發表的數據可公開取得：人類數據
Molè 等，2021：ArrayExpress E-MTAB-8060
Xiang 等，2020：Gene Expression Omnibus GSE136447
Zhou 等，2019：Gene Expression Omnibus GSE109555
Petropoulos 等，2016：ArrayExpress E-MTAB-3929
Blakely 等，2015：Gene Expression Omnibus GSE66507
Yan 等，2013：Gene Expression Omnibus GSE36552
Yang 等，2021：Gene Expression Omnibus GSE148683
Ma 等，2019：Gene Expression Omnibus GSE130114
Nakamura 等，2016：Gene Expression Omnibus GSE74767
用於分析這些數據的代碼可在以下位置取得
B.A.T.W. 和 C.W.G. 設計、實施並分析了實驗。B.A.T.W.、C.W.G. 和 L.K.I-S. 開展了人類胚胎相關工作。N.H. 和 R.M.D. 製備了 10x multiome 文庫，並在 J.S. 的指導下完成了 RNA 和 ATAC 測序。B.A.T.W. 分析了單細胞測序數據。C.W.G. 和 B.A.T.W. 在所有共同作者的意見支援下撰寫了手稿。M.Z-G 構思並指導了該項目。
M.Z-G、B.A.T.W 和 C.W.G 是題為“Stem Cell Derived-Model of the Human Embryo”的專利發明人。
(A) 在圍植入期人類胚胎發育過程中，使用 SCENIC 推斷得到的上胚層、下胚層和滋養層基因調控網絡。有關數據集和處理流程的詳細資訊見方法部分。(B) 採用 SCENIC 對下胚層標誌物 GATA6、SOX17 以及 TrB 標誌物 GATA3 和 TFAP2C 的 regulon 活性進行評分。(C) 在三種多能性狀態下，分別或聯合誘導 GATA6（iG6）、誘導 SOX17（iS17）或誘導 GATA6-SOX17（iG6-S17）3 天后的 qRT-PCR 分析。
N=3 個生物學重複，每個生物學重複含 3 個技術重複。(D) 在多種多能性起始狀態下，DOX 誘導誘導型 GATA3（iG3）、誘導型 AP2γ（iAγ）或誘導型 GATA3-AP2γ（iG3-Aγ）3 天后的 qRT-PCR 分析。N=3 個生物學重複，每個生物學重複含 3 個技術重複。注意，在 (C) 和 (D) 中，誘導轉基因以紅色標示。
(A) 對可誘導 GATA6（iG6）、可誘導 SOX17（S17）或可誘導 GATA6-SOX17（iG6-S17）細胞在多種多能性狀態下誘導 3 天后的免疫熒光分析。(B) 對 A 的定量分析。(C) 對可誘導 GATA3（iG3）、可誘導 AP2γ（iAγ）或可誘導 GATA3-AP2γ（iG3-Aγ）在多種多能性狀態下誘導 3 天后的免疫熒光分析。注意，在 (B) 和 (D) 中，誘導轉基因以紅色標示。所有實驗均為 N=2 次獨立實驗中的 3 個技術重複。
(A) 在卵黃囊樣細胞（Activin-A、CHIR99021 和 LIF）定向分化、多西環素介導的可誘導 GATA6-SOX17 細胞誘導，或兩者聯合處理後，對 GATA6、SOX17 和 SOX2 進行比較與定量。細胞在 RSeT 條件下分化獲得。(B) 在卵黃囊樣細胞（Activin-A、CHIR99021 和 LIF）定向分化、多西環素介導的可誘導 GATA6-SOX17 細胞誘導，或兩者聯合處理後，對 EOMES、N-Cadherin 和 OTX2 進行比較與定量。
N=2994 個細胞。(C) 在 PA（PD0325901 和 A83-01）或 PAL（PD0325901、A83-01 和 LPA）定向分化、多西環素介導的可誘導 GATA3-AP2γ 細胞誘導，或兩者聯合處理後，對 GATA3、AP2α 和 SOX2 進行比較與定量。
(D) 在 PA（PD0325901 和 A83-01）或 PAL（PD0325901、A83-01 和 LPA）定向分化、多西環素介導的可誘導 GATA3-AP2γ RSeT 細胞誘導，或兩者聯合處理後，對 GATA2、KRT7 和 AP2γ 進行比較與定量。N=2368 個細胞。分化在 RSeT 條件下的人胚胎幹細胞（hESC）中進行。
(A) 對野生型、可誘導 GATA6-SOX17 和可誘導 GATA3-AP2γ RSeT hESC 群體測序後，在多西環素誘導 3 天時所選基因的 UMAP 投影。誘導在 RSeT 條件下的人胚胎幹細胞中進行。
(A) 用於測序的可誘導人胚樣體在第 4、6 和 8 天選取的明場圖像（每個階段 n=12）。注意可見一個內部區域被兩個同心區域所包圍。 (B) 該幹細胞來源模型中上胚層、內胚層和中胚層，以及滋養層和羊膜的代表性標誌基因表達。 (C) 將可誘導人胚樣體細胞投射到食蟹猴上的 scmap 投影（
(A) HAND1 的免疫熒光顯示其在 GATA6 陽性細胞（推定的胚外間充質）中表達，並且在推定羊膜（AP2γ 陽性）中其表達於第 4 天至第 6 天之間上調。 (B) 的表達
(A) 使用 CellPhoneDB 生成的簇間預測相互作用圖譜。(B) 可誘導 GATA6-SOX17（G6-S17）和可誘導 GATA3-AP2γ（G3-AP2γ）細胞在誘導 3 天后與野生型 RSeT hESC 的預測相互作用，後者為聚集生成可誘導人胚樣體的細胞類型。(C) 若排除誘導的 GATA3-AP2γ 細胞，則無法形成可誘導人胚樣體。(D) Aggrewell 整體概覽顯示 BMP 抑制對 NODAL 啟用的影響。注意到在 BMP 抑制後，表達 SOX2 的組織良好結構顯著增加。
(A) 聚集後第 6 天 CER1 和 SOX2 的免疫熒光顯示，在由可誘導 GATA6（iG6）或可誘導 GATA6-SOX17（iG6-S17）下胚層樣細胞與野生型 ESC 及可誘導 GATA3-AP2γ（iG3-AP2γ）細胞共同生成的結構中，此階段 SOX2 和 CER1 均下調。
作者感謝 CARE Fertility、Herts and Essex Fertility Centre、Bourn Hall Fertility Clinic 和 King’s Fertility Clinic 在捐贈多餘人類胚胎方面的合作。作者感謝 M.Z-G 實驗室和 Boroviak 實驗室的所有成員，感謝 Gianluca Amadei 提出的深思熟慮的意見，以及 Marta Shahbazi 和 David Glover 對稿件提出的反饋意見。
本研究獲得了 Wellcome Trust、Open Atlas 和 NOMIS 授予 M.Z-G 的資助，Allen Discovery Center for Cell Lineage Tracing 授予 J.S. 和 M.Z-G. 的資助，此外還獲得了 Gates Cambridge Trust 對 B.A.T.W. 的個人資助以及 Leverhulme Trust Early Career Fellowship 對 C.W.G. 的資助。J.S. 是霍華德·休斯醫學研究所的研究員。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.15.545082
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