針對組織構建的胚胎發育策略工程化在再生醫學中展現出非凡前景。這重新激發了人們對細胞生物物理特性與形態轉變之間關係的興趣。然而，利用現有技術，將基因或蛋白表達數據映射到細胞生物物理特性，進而映射到物理形態發生，仍然具有挑戰性。在此，我們提出MATCHY（
細胞群體力學是組織形態發生的近因（
MATCHY能夠在成分複雜的混合體系中定量細胞的生物物理參數，並以高通量方式將其與細胞類型/信號狀態關聯起來。(A) 發育與疾病中生物物理因素對組織組織化貢獻的示意圖。細胞的轉錄狀態和信號狀態表現為生物物理特性，這些特性通過遷移、增殖和分選決定組織組織化。因此，細胞牽引力和黏附測量對於組織組織化和功能具有預測價值。(B) MATCHY牽引力與黏附測定的微加工流程示意圖。(C) 用於高通量細胞生物物理定量及基於連續免疫熒光分析進行事後細胞類型/信號狀態判定的自動化計算流程示意圖。
(D) 分別針對解離的原代E17小鼠胚胎腎細胞和iPSC來源腎細胞譜系的高通量牽引力與黏附數據示例。牽引力數據總結為馬賽克圖像（
阻礙在不同發育系統中構建生物物理層面理解的一個困難，是缺乏可及的細胞與組織力學表徵工具。原子力顯微鏡（AFM）等技術（
這些數據共同確立了MATCHY作為一種用於細胞混合體系力學分析的靈活工具，併為通過MET實現腎單位形成提供了生物物理學基礎。通過將此類數據與組織化結果聯繫起來，我們為通過細胞工程或其他需要初始或邊界生物物理條件的方法實現合成腎發生建立了工程藍圖。這些數據將為未來構建均一、緻密的功能性腎單位陣列以承擔腎臟替代功能的工作提供資訊。MATCHY被設計用於多種細胞系統，可在發育、疾病和工程化組織等多樣化應用中實現對組織化過程的生物物理表徵。
我們設計MATCHY以同步、多重測量細胞牽引力、細胞—細胞黏附以及蛋白生物標誌物表達，從而將細胞身份/狀態與生物物理資訊相關聯。對於MATCHY的牽引力模組，我們製備了具有經驗證力學性質的聚丙烯酰胺凝膠薄片（
在驗證了與免疫熒光整合的MATCHY牽引力顯微測量（TFM）之後，我們進一步嘗試利用原代小鼠胚胎腎細胞構建腎單位形成生態位的生物物理圖譜（
原代小鼠腎發生微環境細胞的生物物理圖譜揭示了伴隨腎單位祖細胞分化發生的能量棘輪機制。（A）
接下來，我們試圖量化這些分子層面的變化如何影響分化中的腎單位祖細胞的細胞生物物理性質。採用傳統方法對沿分化軌跡的密切相關細胞譜系進行牽引應力繪製，需要先將其分別分選並檢測；而對於稀有細胞類型或表面標誌物譜特徵不明確的細胞，這一過程具有挑戰性，甚至不可能。另一種方法是構建譜系特異性報告小鼠，通過內源性熒光標記感興趣的細胞類型（
為補充與MET相關的單細胞牽引力增加模型及細胞-細胞黏附數據，我們改造了一種基於微孔的策略，以構建高度並行化的細胞雙聯體陣列（
此外，細胞-細胞黏附似乎在大約RV階段達到最大值，而牽引力則持續增加直至BRV階段。這種時序關係可能是建立足夠細胞-細胞黏附所必需的，從而允許腎單位在形成S形體時發生劇烈的形態變化（
隨後，我們進一步思考：基於原代小鼠腎細胞牽引力和黏附數據的生物物理建模，是否能夠預測微環境及早期腎單位的自組織。類似模型已成功預測了其他多細胞結構（如乳腺腺泡）的自組織（
細胞收縮性和黏附特性中的能量棘輪足以解釋早期腎單位凝聚過程，並且在一定程度上足以解釋隨後發生的極化。（A）腎單位形成過程中，細胞-細胞黏附和張力中的能量棘輪可能影響的性質示意圖。（B）基於細胞生物物理性質驅動的離散化小鼠胚胎腎細胞自組織假說示意圖。（C）腎發生微環境自組織的基於智能體的模擬。
我們將該模型與一種自組織實驗結合，該實驗由相同原代細胞的球體培養構成（
基因表達和信號通路通過單細胞及超細胞尺度的生物物理性質發揮作用，從而決定組織結構（
我們在此的工作也留下了若干值得未來研究和思考的方向。首先，我們未考慮輸尿管芽或基質細胞的牽引力或黏附特性。這些區室構成了重要的微環境邊界界面，可能對腎單位祖細胞的分選動力學產生貢獻。例如，輸尿管芽通過多種細胞-細胞及細胞-基質配體-受體對與腎單位祖細胞發生黏附相互作用，其中尤以ITGA8-腎連接蛋白（nephronectin）最為顯著，而這一相互作用對於恰當的微環境組織是必需的（
總之，MATCHY 為現有細胞生物物理表徵技術提供了一種高通量且用戶友好的擴展。MATCHY 為機械生物學研究和新興組織工程策略提供了強有力的基準測試工具。這些策略旨在通過合成方式調控並利用自組織原理，以構建具有進一步發育潛能的複雜組織“種子”（
相對於通過細胞裂解或固定生成的鬆弛 TFM 凝膠狀態所測得的 iPSC 細胞牽引力圖（超過100個細胞，跨越
遠端腎單位細胞（DN）和輸尿管芽上皮（UB）由 GATA3
在進行 DN 誘導的前一天，將細胞以每孔 200k 個細胞的密度鋪板前，先檢查是否存在非目標分化。使用完全培養基培養細胞 24 小時，隨後更換為添加補充劑的 TeSR-E6 培養基（TeSR-E6+）（STEMCELL Technologies 05946）和 7μM CHIR 99021（Tocris, 4423），培養 4 天。
第 5 天，將培養基更換為 TeSR-E6+、1 μg/ml 肝素（Sigma-Aldrich H4784）、600 ng/ml FGF2（PeproTech, 100-18B）和 1 μM CHIR，繼續培養 3 天。第 8 天，將細胞按 1:1 比例傳代至置於標準細胞培養箱（37°C、5% CO₂）中、放置於軌道搖床上並以 60 rpm 搖動的超低吸附 6 孔板（Corning, CLS3471）中。
對於 UB 誘導，在分化前一天，將細胞以每孔 50k 個細胞的密度鋪於標準組織培養處理的 6 孔板中。24 小時後，使用 TeSR-E6+ 和 7μM CHIR 培養 4 天，隨後使用 600 ng/ml FGF2 加 1 μg/ml 肝素培養 3 天，然後將細胞解離並重懸至 200k cells/μl。通過在 6 孔 Transwell 板上滴加 3 μl 細胞懸液製備細胞“pucks”，下室加入 1 ml 含 7 μM CHIR 的 TeSR-E6+。
孵育 1 小時後，將培養基更換為 600 ng/ml FGF2 加 1 μg/ml 肝素，繼續培養 5 天，並每隔一天換液一次。隨後將培養基切換為含 0.1 μM TTNPB（Tocris, 0761）的 TeSR-E6+，再培養 9 天；在此期間，下室加入 1 ml 培養基，並每隔一天更換一次。
GATA3-YFP+ 的 DN 和 GATA3-mCherry+ 的 UB 在分化結束時被解離並經 FACS 純化。細胞懸液經 40 μm 細胞濾網過濾後，聚集並以 1ml cells/ml 重懸於含 2% FBS 的 PBS 中。使用 100 μm 噴嘴、約 600 events/s 的流速對陽性細胞進行分選。純化結束後收集細胞，並重懸於 TeSR-E6+ 中，隨後用於實驗。
Madin-Darby 犬腎（MDCK）上皮細胞維持於最低必需培養基（MEM，Earle’s salts 和 L-glutamine，#MT10-010-CM，Corning）中，培養基補充 10% FBS 和 100 U ml
在進行用於收縮性表徵的細胞接種之前，先用DPBS清洗MDCK細胞培養物1 min，隨後以0.25%胰蛋白酶-EDTA處理10 min。使用完全培養基終止消化，並以300 g微量離心3 min使細胞沉澱聚集。將細胞懸液重懸至400,000個細胞/ml，每孔接種0.5 ml於8孔腔室載玻片中。為刺激pERK過表達，加入100 ng/ml可溶性重組人GFRA1（R&D Systems，AF714-SP）以及50 ng/ml重組人GDNF（R&D Systems，212-GD-010），處理12 hr。
ROCK抑制劑（STEMCELL Technologies，72304）和blebbistatin（Tocris，1852）處理濃度分別為10 µM和50 µM。
小鼠實驗方案遵循NIH指南，並經賓夕法尼亞大學機構動物護理和使用委員會批准。按照定時妊娠方案從CD-1小鼠（Charles River）取得E17胚胎，並如前所述根據肢體解剖特徵確認發育階段（
免疫熒光染色和成像如前所述進行（
腎臟在35 mm玻底培養皿（FD35-100，World Precision Instruments）中成像，培養皿內放置一層厚約5 mm、配比為15:1（基質:交聯劑）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）彈性體（Sylgard 184，2065622，Ellsworth Adhesives），並使用直徑2 mm的活檢衝孔器在其中製備孔洞。
成像使用Nikon Ti2-E顯微鏡進行，配備CSU-W1旋轉盤（Yokogawa）、白光LED、激光照明系統（100 mW的405、488和561 nm激光器，以及75 mW的640 nm激光器）、Prime 95B背照式sCMOS相機（Photometrics）、電動載物台、4x/0.2 NA、10x/0.25 NA和20x/0.5 NA物鏡（Nikon），以及載物台頂部環境控制罩（OkoLabs）。
原代胚胎小鼠腎發生完整微環境細胞懸液是在改良先前所述方案的基礎上製備的（
如前所述，使用帶有精確凝膠間距墊片的100 mm直徑機械級硅片（University Wafer）進行製備（
標準顯微鏡載玻片經功能化處理以實現聚丙烯酰胺（PA）凝膠的共價附着，方法為先在1N氫氧化鈉（NaOH，S8045，Sigma）中蝕刻15 min，再以3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯（440159，Sigma）、乙酸（EMD Millipore）和去離子（DI）水按2:3:5比例配製的溶液進行硅烷化處理，方式為將150 µL該溶液夾置於兩張載玻片之間。該“載玻片夾層”在室溫下孵育至少30 min，隨後用100%甲醇和DI水沖洗。
將經硅烷化處理的一側玻片面朝下放置於晶圓上的墊片之上。
PA 凝膠前體溶液通過依次移取以下組分配製：645.5 µL 去離子水、187.5 µL 丙烯酰胺溶液（40% w/v Acrylamide Solution，1610140，Bio-Rad）、100 µL 10× DPBS（14200075，Thermo Fisher Scientific）、35 µL N,N-亞甲基雙丙烯酰胺交聯劑（2% w/v bis-acrylamide Solution，1610142，Bio-Rad）、20 µL 以去離子水按 1:100 稀釋的熒光微球（FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 µm，660/680，F8807，Thermo Fisher Scientific）、6 µL 10% v/v 四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma）以及 6 µL 溶於去離子水中的 10% w/v 過硫酸銨（Sigma）。
由該前體形成的 PA 凝膠的楊氏模量為 6 kPa（
為使用 NHS 酯對凝膠表面未偶聯的丙烯酰胺鏈進行衍生化，以實現黏附蛋白的功能化，將溶於 50 mM（pH 6.0）4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，40820004，bioWORLD）緩衝液中的 0.01%（w/v）N,N-亞甲基雙丙烯酰胺與 0.09%（w/v）苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸鋰（LAP 光引發劑，900889，Sigma）以及 0.1%（w/v）丙烯酸混合-
來自原代組織或細胞培養板的細胞懸液（見
為讀取牽引力，細胞在 1× DPBS 中用 4% 多聚甲醛（16% PFA，15710，Electron Microscopy Sciences）固定 20 min，並用 DPBS 清洗 4 次，每次 5 min。隨後將孔板置於共聚焦顯微鏡上，並通過手動精細調整玻片四角進行全局配準，以對齊此前在全牽引狀態下記錄的相同位置。在校正全局平移和旋轉位移後，相同的
對於後續免疫熒光實驗，細胞在 1× DPBS 中用 0.5% v/v Triton X-100 透化 5 min，隨後在 IF 洗滌緩衝液（1% w/v BSA、2% v/v Triton X-100、0.41% v/v Tween-20，EMD Millipore，1× DPBS）中含 1% BSA 的封閉液封閉 1 hr。
隨後，將各孔與熒光團偶聯的一抗孵育：第一組為兔抗-Six2（11562-1-AP，Proteintech，RRID: AB_2189084），標記Alexa Fluorphore 555（Novus，333-0010）；鼠抗-Lhx1（CF504527，OriGene，RRID: AB_2724601），標記Alexa Fluorphore 647（Novus，336-0010）；以及兔抗Cited1-488（Proteintech，CL48826999100UL，RRID: AB_2919211）。
另一組為兔抗-SIX2-555、鼠抗-LHX1-647，以及山羊抗-JAG1（AF599，R&D Systems，RRID: AB_2128257），標記Alexa Fluophore 488（Novus，332-0005）。所有一抗首先使用抗體純化試劑盒（Novus，861-0010）進行純化，隨後根據說明書與熒光團偶聯。所有偶聯抗體均按1:50稀釋，於4°C過夜孵育。隨後，在避光條件下用IF緩衝液清洗細胞3次，每次1小時，並以150 nM DAPI復染細胞核15分鐘。
F-肌動蛋白採用1X Phalloidin-555（Abcam，ab176756）於PBS + 1% BSA中染色1小時。最後，在進行抗體標誌物的共聚焦免疫熒光成像前，用IF緩衝液和PBS分別清洗各孔1小時，使用20 µm
圖像分析採用ImageJ/Fiji中的自動化宏程序進行（
接觸角測定實驗改編自Cerchiari
細胞在成像後立即固定並染色。相同的
解離的E17細胞以每孔50,000個細胞的密度接種於96孔超低吸附圓底板（Corning 7007）中，培養於Advanced RPMI 1640培養基和Glutamax中（見
採用Python實現的Cellular Potts Model（CPM）改編自Bao
該方程描述了細胞面積懲罰項（左項）、收縮性/皮層張力（中項）以及同型/異型黏附（右項）。各項定義見Bao
ωi：細胞所佔據的晶格點x，y
相關細胞類型以相似的
由Combes中解離的E18.5小鼠胚胎腎臟scRNA-seq生成的基因表達矩陣
採用MATLAB進行單因素方差分析（ANOVA），並使用Tukey誠實顯著性差異檢驗進行多重比較校正，同時進行配對和非配對
我們衷心感謝Gregory Dressler（密歇根大學）慷慨贈予MDCK-RET9細胞。感謝John Viola和Samuel Grindel在實驗方案和球體分割方面分享其專業經驗。本研究部分工作在賓夕法尼亞大學Singh納米技術中心完成，該中心由NSF國家納米技術協調基礎設施項目（NNCI-2025608）支援。本研究部分獲得NSF通過賓夕法尼亞大學材料研究科學與工程中心（MRSEC，DMR-2309043）的資助。
本研究還獲得NSF GRFP獎學金（JL）、NIH F32 DK126385（LSP）、NIH NIGMS MIRA R35GM133380（AJH）、NIH NIDDK R01DK132296（AJH）以及NSF CAREER獎（2047271，AJH）的支援。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.02.07.579368
🏷️ 細胞黏附 牽引力測量 組織形態發生 腎單位發育 高通量篩選