基於幹細胞的胚胎模型是研究早期胚胎發生的有前景的替代方案。我們引入了兩種不同的模型，以複製小鼠胚胎發育過程中胚外內胚層與上胚層之間的動態關係。誘導型
小鼠著床前發育的特徵是兩次細胞命運決定，每次都會導致譜系分離[
基於幹細胞的胚胎模型已成為研究哺乳動物胚胎早期發育的有吸引力的替代方案，但它們並非沒有侷限性。小鼠整合性胚胎模型，如 blastoid[
在此，我們詳細介紹了採用兩種方法穩健生成類似內細胞團結構的過程：誘導型的聚集
為了形成一種具有生成 PrE 和上胚層潛能的雙潛能內細胞團細胞，我們構建了誘導型（i
A. 用於構建 i 的 DNA 構建體示意圖
在持續表達 Cherry 陽性的 ES 細胞系擴增後，對正確靶向的克隆進行了檢測，以評估
早期囊胚（E3–E3.25）的內細胞團細胞尚未決定命運，並且由於其共表達，具有形成 PrE 或上胚層的潛能
不依賴 Hippo 的位置依賴性 PrE 發育及細胞分選促進了 PrE 在 i 兩者周邊的定位
A. 對影響 Hippo 通路活性的小分子在位置依賴性 PrE 發育中的影響進行評估。i
關於早期囊胚內細胞團由隨機混合的細胞組成，且這些細胞顯示不同水平的 GATA6 或 NANOG 表達的觀察結果，對“位置是決定細胞命運唯一因素”的假說提出了挑戰[
為了檢驗內細胞團中的這種功能性細胞分選是否可以被建模[
A. 柱狀圖顯示，與初始 ES 細胞相比，第 1–2 天 ICM 類胚體中 Cherry 陽性細胞的前 50 個上調基因所富集的 Reactome 通路。柱子的顏色基於與各通路相關的上調基因數量。B. 初始 ES 細胞與 ICM 類胚體（第 1–4 天）scRNA-seq 數據的整合。UMAP 圖顯示了標準化表達的
來自初始狀態 ES 細胞以及在 ICM 類胚體中聚集後的單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）數據表明，這兩類細胞群體具有兩條不同的發育路徑（
E3.5 的內細胞團呈現上胚層與 PrE 已決定細胞的“鹽和胡椒”式分佈，而從 E4.5 開始，這些細胞發生分選，由 PrE 覆蓋初始上胚層[
通過擬時序和 RNA 速度分析確定的 EGFP 陽性細胞發育軌跡，與在連續天數收集的 ICM 類胚體中觀察到的上胚層發育連續階段相對應（
A. 初始 ES 細胞與 ICM 類胚體（第 1–4 天）scRNA-seq 數據整合的 UMAP 圖，按鑑定的簇着色，箭頭表示 RNA 速度。B. 顯示標準化表達的 UMAP 圖
A. 以相對擬時序着色的 UMAP 圖，顯示 Cherry 陽性簇中原始內胚層和胚外內胚層的發育、數據集組成、採用 Louvain 方法鑑定的簇，以及歸一化表達
我們對 ICM 類胚體中源自 PrE 細胞的擬時序軌跡分析揭示了若干關鍵的 DVE/AVE 標誌物的存在（
ICM 類胚體內源自 PrE 和上胚層的譜系發育軌跡受多種細胞間相互作用調控，如 CellPhoneDB 所預測[
A. 熱圖顯示 CellPhoneDB 在每天各細胞類型之間鑑定出的顯著發送相互作用數量。B-C. 點圖顯示在 EGFP（B）或 Cherry（C）譜系中至少一種組合內顯著的 CellPhoneDB 相互作用，並按通路排序。僅顯示該譜系中至少具有 3 個顯著相互作用的通路。點的大小和顏色分別表示平均相互作用評分，顯著點以黑色邊框突出顯示。
A. 點圖顯示按通路分組的 ICM 類胚體中跨膜基因的歸一化表達。顏色表示歸一化基因表達，而點的大小反映表達該基因的細胞百分比。B. 點圖顯示按通路分組的 ICM 類胚體中效應基因的歸一化表達。C. 點圖顯示按通路分組的 ICM 類胚體中受體的歸一化表達。D. 點圖顯示圖中所示胚胎簇內若干通路效應基因的歸一化表達
根據我們對效應基因的評估，ICM 類胚體第 2 天上胚層中從 naïve 多能性退出伴隨着 JAK/STAT 信號的下降（
基於效應基因的表達
在小鼠胚胎的 primed 上胚層中，NODAL 維持不足或暴露於 BMP4 會阻礙原條形成所必需的 WNT 信號上調[
ICM 中上胚層和 PrE 的形成依賴於位置線索和細胞分選動態。隨後，上胚層在進一步發育過程中獲得前後軸之前，會先從 naïve 多能狀態轉變為 primed 多能狀態。然而，由於植入期間胚胎脆弱且體積微小，難以在不損傷的情況下將其從子宮中分離，再加上當前小鼠整合型胚胎模型（如 blastoids）的侷限性，研究這一發育階段具有挑戰性[
根據擬時序分析，我們的 ICM 類胚體中源自 PrE 的譜系其預設發育狀態似乎為 DVE/AVE。DVE/AVE 的建立及其侷限於特定區域依賴於 NODAL 與 BMP 信號之間的動態平衡[
除提供一種穩健的、非整合型的基於幹細胞的胚胎模型用於研究發育外；ICM 類胚體還為改進 ETX 類胚體的構建提供了有價值的見解。去除 i
總之，所觀察到的相似性介於
小鼠ES細胞的建立與培養按照先前描述的方法進行[
細胞收集後儲存在裂解緩衝液中（Promega ReliaPrep RNA Cell Miniprep，貨號z6012），於-20°C保存直至進一步處理。解凍後，按照生產商說明書，使用試劑盒（Promega ReliaPrep RNA Cell Miniprep，貨號z6012）分離RNA，並以50 µl水洗脱。總計取500–1000 ng RNA，按照生產商方案，使用隨機六聚體引物和Superscript III逆轉錄酶（Thermo Fisher，貨號18080093）逆轉錄為cDNA。
將cDNA以水稀釋（1:5）後，使用BioRad CFX384即時PCR儀檢測表達水平。10 µl反應體系包含2× SYBR Green PCR Master Mix（Promega，GoTaq qPCR Master，貨號A6002）、2 µM引物和1 µl稀釋後的cDNA。反應首先在95°C保溫10 min，隨後進行40個循環：95°C 30 sec，60°C 1 min。所使用的即時PCR引物序列見
ICM類胚體以4%多聚甲醛固定20 min，在PBS中清洗（3×5 min），隨後用PBS中0.25% Triton X-100通透處理20 min，再以PBS清洗（3×10 min），並於4°C在封閉液（PBS中0.5% BSA、1% Tween-20）中孵育過夜（最長可達1周）。封閉後，ICM類胚體於4°C用以封閉液稀釋的一抗孵育過夜。隨後在封閉液中清洗（3×10 min）後，於4°C繼續用以封閉液稀釋的二抗孵育額外2天。
2天后，ICM類胚體在PBS中漂洗（3×10 min），首次清洗時加入Hoechst33342至終濃度20 ug/ml。隨後將ICM類胚體包埋於Matrigel液滴中，並使用配備HCX APO 20×水浸物鏡的Leica SP5活體顯微鏡進行成像。圖像使用ImageJ處理。所使用的抗體見
單細胞按照生產商方案，使用10X Genomics Chromium平台和Chromium Next GEM Single Cell 3′ Reagent kit v3.1雙索引試劑盒（10X Genomics）進行處理。簡而言之，每個芯片通道中加載15,000個細胞，將其分隔為乳液凝膠珠（GEMs）。在GEMs內，細胞裂解，隨後對RNA進行帶條形碼的逆轉錄。GEMs破乳後，進行擴增、片段化以及接頭和樣本索引的添加。
文庫合併後，在Illumina NovaSeq6000儀器上以28-10-10-90循環進行測序，目標是每個細胞至少達到25,000條原始reads的測序深度。
不同天數細胞的整合使用scanpy v1.9.1進行[
我們對第1天和第2天的Cherry陽性細胞與Naive細胞之間進行了差異表達分析，以揭示發育過程中被啟用的基因。使用Seurat的FindMarkers函數（min.pct=0.1，logfc.threshold=0.1）鑑定差異表達基因（DEGs），並篩選出上調基因。排名前50的DEGs隨後使用EnrichR v3.2進行通路分析[
使用CellphoneDB v5.0鑑定了不同細胞組之間（即按天數和譜系劃分的細胞）的細胞—細胞相互作用[
基於文獻研究，我們為多個通路選擇了已知的效應分子、配體和受體，這些通路包括JAK/STAT、WNT、ACTIVIN/NODAL、MAPK、Hedgehog、NOTCH和BMP。採用點圖對各譜系在每日的這些已知基因表達進行了可視化。對於每條通路，我們計算了各譜系每日的平均表達量，並將這些數值轉換為z分數。對每個譜系分別將這些分數以隨時間變化的圖示形式進行可視化，其中不同天數之間的差異以梯度表示。
來自ETX胚樣體的scRNA-seq數據按照先前所述方法進行了預處理[
來自胚胎、類囊胚和幹細胞的整合scRNA-seq數據集下載自Posfai等，2021（GSE145609）[
此外，對Nowotschin等，2019（GSE123046）的scRNA-seq數據進行了重新分析[
本研究得以開展，得益於授予JG的ZonMW-PSIDER資助（10250022120002）。
撰寫、審閱與編輯：CD、BT、OS、SM、DH、JG
作者聲明不存在競爭性利益。
本研究生成的所有原始和處理後的scRNA-seq數據均已提交至NCBI Gene Expression Omnibus（GEO），登入號為
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📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.28.630545
🏷️ 小鼠胚胎模型 內細胞團類胚體 原始內胚層 上胚層 細胞命運決定 早期胚胎發育