人胚胎幹細胞系的建立證明嵌合胚胎能夠進行自我校正
Chuyu Li、Jiazi Xie、Juan Dong、Chao Gao、Meng Xia、Yuting Lin 等 3 位作者
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https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1558669/v2
本作品採用 CC BY 4.0 許可協議授權
低水平嵌合現象是人類早期發育的常見特徵。儘管嵌合胚胎可能導致健康活產，但嵌合現象的直接影響尚不明確。雖然在小鼠模型中已證明胚胎具有自我校正能力，但在人類中，僅能通過延長培養來研究染色體異常和囊胚嵌合現象對著床前後早期階段的影響。
按照既定培養方案建立胚胎幹細胞。通過 PGT-A 檢測到 24 枚高質量嵌合/非整倍體嵌合囊胚。分離的內細胞團（ICMs）被接種於無飼養層培養皿中，培養 10–12 天后，共獲得 6 個來源於囊胚 ICM 的幹細胞克隆。在幹細胞生長過程中脱落的細胞被收集，並對幹細胞及脱落細胞進行二代測序。為檢測多能性，分離少量幹細胞並進行傳代培養。
根據幹細胞脱落細胞和幹細胞的二代測序結果確認了 PGD 狀態；5 枚囊胚中的嵌合現象已被完全修復，而 1 枚囊胚中的嵌合現象僅被部分修復。同時，通過免疫熒光、流式細胞術和……驗證了這些細胞具有多能性以及向三個胚層分化的能力。
人類嵌合/非整倍體嵌合囊胚可通過清除嵌合細胞實現自我校正。
嵌合胚胎是指在植入前胚胎中共存有兩種或以上核型不同的細胞系的胚胎。國際植入前遺傳學診斷學會（PGDIS）規定，異常細胞比例為 20% 至 80% 的胚胎為嵌合體，>80% 為非整倍體，<20% 為整倍體[
胚胎嵌合現象可影響胚胎發育潛能，導致種植失敗、流產以及異常胎兒的出生[
基於這一假設，我們分離人類囊胚的內細胞團（ICMs）以建立能夠長期穩定自我更新並具有多向分化潛能的胚胎幹（ES）細胞系[
本研究使用了經 PGT-A 判定為染色體異常的胚胎。本研究中人類囊胚的應用已獲南京醫科大學第一附屬醫院機構倫理委員會批准。本研究的所有方法均按照相關指南和法規執行。所有參與者均年滿 18 歲，並簽署了書面知情同意書。
我們使用了南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心在PGT-A後捐贈的高質量囊胚，共納入13名患者的24枚胚胎（母親年齡29±7歲）進行研究。所有胚胎均接受了標準的
對於經PGT-A檢測為A的胚胎，使用玻璃針小心分離胚胎滋養外胚層和內細胞團。細胞在含5% CO
將少量經消化的人胚胎幹細胞（hESCs）克隆接種於預先準備好的24孔板蓋玻片上。細胞培養4天后，在室溫下用4%多聚甲醛固定20分鐘，並用Dulbecco磷酸鹽緩衝液（DPBS）清洗3次。固定後，將細胞浸沒於100 µl 0.4% TritonX-100/DPBS中，於冰上裂解10分鐘，並用DPBS清洗。加入5% BSA（200 µl/孔），將培養板置於37°C培養箱中封閉30分鐘。加入一抗後，於4°C過夜標記細胞。
所用一抗為兔抗OCT4（1:200，Abcam）、兔抗Nanog（1:200，Cell Signaling Technology）、小鼠抗SSEA4（1:200，Abcam）以及小鼠抗TRA-1-60（1:200，Cell Signaling Technology）。用DPBS清洗3次以去除一抗後，加入二抗，在室溫避光孵育1小時進行標記。
所用二抗為驢抗兔IgG（H+L）（1:1000，Thermo Fisher Scientific）和驢抗小鼠IgG（H+L）（1:1000，Thermo Fisher Scientific）。在載玻片上滴加20 µl封片/封閉液後，用彎針挑起小圓片並翻轉，使其倒置於載玻片上。使用熒光倒置顯微鏡觀察並記錄細胞顯微圖像。
收集細胞，並將其密度調整為1.0 × 10
採用IV型膠原酶和中性蛋白酶消化hESCs，收集細胞克隆並置於超低吸附培養皿中進行懸浮培養。形成一種稱為胚樣體（EB）的小型球狀細胞團。隨着培養天數的增加，EB逐漸增大，表面變得更加光滑。在分化第0、3、7和14天收集EB，加入1:1混合的0.25%胰蛋白酶和II型膠原酶，於37°C水浴中孵育5分鐘，孵育期間每1分鐘混勻一次。消化細胞黏附分子以獲得單細胞後，將其接種於Matrigel包被的小圓片上，在培養箱中培養24小時後，用4% PFA固定，並通過免疫熒光進行檢測。
幹細胞gDNA的全基因組擴增及二代測序
採用多重退火 SurePlex DNA 擴增試劑盒（Illumina：目錄號 F1006000900）按照製造商說明書對幹細胞來源的基因組 DNA（gDNA）進行擴增。隨後，按照 Veriseq DNA 文庫製備試劑盒（Illumina；F1006001002，F1006001002）的操作流程構建用於 NGS 的測序文庫，並在 Illumina MiSeq 平台（Illumina, San Diego, CA, USA）上進行測序。
通過 NGS 對幹細胞進行遺傳篩查以鑑定核型和拷貝數變異
沿 24 條染色體以 4 MB 為 bin 大小統計 reads 數，並以所有樣本中對應 bin 的平均值進行歸一化。我們早期的預實驗數據表明，reads 在染色體上的均勻分佈提示染色體內容物的靶向情況及細胞核型。染色體拷貝數分析流程按照先前報道的方法進行[
共使用了 13 枚患者來源的嵌合/非整倍體嵌合胚胎，且均經診斷為 PGT-A。共培養了 24 個囊胚，所有囊胚在分離內細胞團（ICM）之前均進行了滋養外胚層活檢。分離後的 ICM 接種於塗覆 Matrigel hESC-Qualified Matrix（Corning, USA）的培養板上，10–12 天后獲得了 6 個 ES 細胞克隆。囊胚形態學評分、表型、囊胚 NGS 結果及其對應的細胞碎片和幹細胞克隆形態見表 1。
在形成幹細胞克隆的 6 枚胚胎中，有 2 枚為嵌合囊胚，其脱落細胞碎片中所有染色體均表現為嵌合，而形成的幹細胞克隆則為整倍體（胚胎 A、B）。此外，在 4 枚非整倍體嵌合囊胚中，3 枚發生了嵌合修復（胚胎 C、E、F），1 枚發生了部分嵌合修復（胚胎 D），但在脱落的細胞碎片中僅檢測到 1 個嵌合細胞（胚胎 D）。同時還檢測了染色體嵌合性的存在：1 枚非整倍體嵌合囊胚已實現完全修復，包括其非整倍性在內（胚胎 F）。
在顯微鏡下觀察時，可見 hESCs 呈克隆性生長，形成邊界清晰、結構緻密的多細胞集落。細胞排列緊密，具有較高的核質比和明顯的核仁。健康的集落無縫融合為緊密的細胞簇，中心區域具有多層細胞。免疫熒光和流式細胞術分析顯示，hESCs 高表達幹細胞標誌物 OCT4、NANOG、SSEA4 和 TRA-1-60。該
在本報告中，我們描述了嵌合/非整倍體嵌合的 ICM 的形成
本研究探討了嵌合胚胎在發育過程中是否能夠對其染色體進行自我修復。與先前研究不同，這些胚胎僅
用於 PGT-A 的新型診斷技術，即可在單細胞水平檢測胚胎非整倍體的快速低深度全基因組二代測序方法的發展，導致了有關胚胎嵌合體現象報道的增加[
已知嵌合現象的發生率會隨着發育進程而降低，並且在囊胚中的發生頻率低於卵裂期胚胎[
來自嵌合小鼠模型的植入前胚胎被發現其非整倍體細胞呈進行性減少。由整倍體細胞和非整倍體細胞組成的嵌合體在內細胞團（ICM）中表現出非整倍體細胞的選擇性凋亡，而在滋養外胚層（TE）中的非整倍體細胞則表現出增殖缺陷，從而導致自囊胚階段開始非整倍體細胞的進行性耗竭[
2019年，Popovich等人應用二代測序研究了經擴展
然而，染色體異常檢測方法仍然導致囊胚嵌合體在臨床上具有顯著發生率，因為 PGT-A 將活檢中平均5–6個細胞的染色體組成視為代表整個胚胎，這也由此引發了爭議。Gleicher 等人使用數學模型提出，嵌合細胞在滋養外胚層中呈均勻分佈，且活檢中至少需要27個滋養外胚層細胞，才能代表整個囊胚的核型[
本研究的發現加深了對人類嵌合囊胚自我糾正能力的認識。用於建立幹細胞的 ICM 分離方法為胚胎通過非整倍體細胞凋亡實現自我糾正提供了直接證據。這些發現可為輔助生殖中的嵌合胚胎選擇提供參考
本研究已獲得南京醫科大學倫理委員會批准（2012-SR-128）
本研究中使用和/或分析的數據集可在合理請求下向通訊作者取得。
作者聲明，不存在任何已知的競爭性經濟利益或可能對本文所報告工作產生影響的個人關係。
本研究獲得國家自然科學基金（81730041，81671447）及國家重點研發計劃（2021YFC270050，2017YFC1001301）資助。作者聲明不存在競爭性利益。
CL 設計了研究，實施了實驗，分析了數據，並撰寫了手稿。JX 和 CG 參與了全基因組擴增和二代測序。JD 協助建立了幹細胞系。MX 和 YL 參與了胚胎培養和 PGT-A。YC、LQ 和 WW 對論文進行了重要修改。所有作者均參與了結果解釋並審閱了文章。
生殖醫學國家重點實驗室，南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學臨床中心，南京醫科大學，江蘇南京 210029，中國
表1. 囊胚PGT-A、其對應的細胞碎片及hESC的外觀和NGS結果
+4（嵌合，34%）、+6（嵌合，38%）、+14（嵌合，44%）、+Y（嵌合，29%）
-7（p22.3-p11.2）（嵌合，37%，57.60Mb）、-13（q12.11-q34）（嵌合，30%，95.49Mb）
+8（p12-qter）（嵌合，67%，114.96Mb）、+19（嵌合，41%）、+20（嵌合，36%）；-5（q14.3-qter）（嵌合，35%，93.10Mb）、-22（q11.21-q13.33）（21.36Mb）
+8（p12-q24.3）（114.96Mb）、-22（q11.21-q13.31）（28.96Mb）
+8（p12-q24.3）（115.56Mb）、-22（q11.21-q13.31）（28.96Mb）
+1（q32.3-qter）（34.63Mb）、+13（q12.11-q12.3）（嵌合，50%，12Mb）；-11（q13.3-qter）（嵌合，38%，65.14Mb）、-13（q12.3-qter）（嵌合，26%，83.02Mb）
+1（q32.3-q44）（34.63Mb）、+11（p15.5-q13.4）（嵌合，39%，73.91Mb）、-11（q13.4-q25）（嵌合，40%，60.97Mb）、-13（q13.1-q34）（嵌合，63%，82.29Mb）
+1（q32.3-q44）（34.63Mb）、-11（q13.4-q25）（嵌合，48%，60.97Mb）、-13（q21.33-q34）（嵌合，50%，45.09Mb）
+2（p11.2-qter）（嵌合，29%，154.78Mb）、+21；-2（pter-p11.2）（嵌合，36%，86.53Mb）
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© Research Square 2026 | ISSN 2693-5015（網絡版）
📄 原文連結：https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1558669/v2
🏷️ 人胚胎幹細胞 嵌合胚胎 自我校正 囊胚 內細胞團 染色體異常