针对组织构建的胚胎发育策略工程化在再生医学中展现出非凡前景。这重新激发了人们对细胞生物物理特性与形态转变之间关系的兴趣。然而，利用现有技术，将基因或蛋白表达数据映射到细胞生物物理特性，进而映射到物理形态发生，仍然具有挑战性。在此，我们提出MATCHY（
细胞群体力学是组织形态发生的近因（
MATCHY能够在成分复杂的混合体系中定量细胞的生物物理参数，并以高通量方式将其与细胞类型/信号状态关联起来。(A) 发育与疾病中生物物理因素对组织组织化贡献的示意图。细胞的转录状态和信号状态表现为生物物理特性，这些特性通过迁移、增殖和分选决定组织组织化。因此，细胞牵引力和黏附测量对于组织组织化和功能具有预测价值。(B) MATCHY牵引力与黏附测定的微加工流程示意图。(C) 用于高通量细胞生物物理定量及基于连续免疫荧光分析进行事后细胞类型/信号状态判定的自动化计算流程示意图。
(D) 分别针对解离的原代E17小鼠胚胎肾细胞和iPSC来源肾细胞谱系的高通量牵引力与黏附数据示例。牵引力数据总结为马赛克图像（
阻碍在不同发育系统中构建生物物理层面理解的一个困难，是缺乏可及的细胞与组织力学表征工具。原子力显微镜（AFM）等技术（
这些数据共同确立了MATCHY作为一种用于细胞混合体系力学分析的灵活工具，并为通过MET实现肾单位形成提供了生物物理学基础。通过将此类数据与组织化结果联系起来，我们为通过细胞工程或其他需要初始或边界生物物理条件的方法实现合成肾发生建立了工程蓝图。这些数据将为未来构建均一、致密的功能性肾单位阵列以承担肾脏替代功能的工作提供信息。MATCHY被设计用于多种细胞系统，可在发育、疾病和工程化组织等多样化应用中实现对组织化过程的生物物理表征。
我们设计MATCHY以同步、多重测量细胞牵引力、细胞—细胞黏附以及蛋白生物标志物表达，从而将细胞身份/状态与生物物理信息相关联。对于MATCHY的牵引力模块，我们制备了具有经验证力学性质的聚丙烯酰胺凝胶薄片（
在验证了与免疫荧光整合的MATCHY牵引力显微测量（TFM）之后，我们进一步尝试利用原代小鼠胚胎肾细胞构建肾单位形成生态位的生物物理图谱（
原代小鼠肾发生微环境细胞的生物物理图谱揭示了伴随肾单位祖细胞分化发生的能量棘轮机制。（A）
接下来，我们试图量化这些分子层面的变化如何影响分化中的肾单位祖细胞的细胞生物物理性质。采用传统方法对沿分化轨迹的密切相关细胞谱系进行牵引应力绘制，需要先将其分别分选并检测；而对于稀有细胞类型或表面标志物谱特征不明确的细胞，这一过程具有挑战性，甚至不可能。另一种方法是构建谱系特异性报告小鼠，通过内源性荧光标记感兴趣的细胞类型（
为补充与MET相关的单细胞牵引力增加模型及细胞-细胞黏附数据，我们改造了一种基于微孔的策略，以构建高度并行化的细胞双联体阵列（
此外，细胞-细胞黏附似乎在大约RV阶段达到最大值，而牵引力则持续增加直至BRV阶段。这种时序关系可能是建立足够细胞-细胞黏附所必需的，从而允许肾单位在形成S形体时发生剧烈的形态变化（
随后，我们进一步思考：基于原代小鼠肾细胞牵引力和黏附数据的生物物理建模，是否能够预测微环境及早期肾单位的自组织。类似模型已成功预测了其他多细胞结构（如乳腺腺泡）的自组织（
细胞收缩性和黏附特性中的能量棘轮足以解释早期肾单位凝聚过程，并且在一定程度上足以解释随后发生的极化。（A）肾单位形成过程中，细胞-细胞黏附和张力中的能量棘轮可能影响的性质示意图。（B）基于细胞生物物理性质驱动的离散化小鼠胚胎肾细胞自组织假说示意图。（C）肾发生微环境自组织的基于智能体的模拟。
我们将该模型与一种自组织实验结合，该实验由相同原代细胞的球体培养构成（
基因表达和信号通路通过单细胞及超细胞尺度的生物物理性质发挥作用，从而决定组织结构（
我们在此的工作也留下了若干值得未来研究和思考的方向。首先，我们未考虑输尿管芽或基质细胞的牵引力或黏附特性。这些区室构成了重要的微环境边界界面，可能对肾单位祖细胞的分选动力学产生贡献。例如，输尿管芽通过多种细胞-细胞及细胞-基质配体-受体对与肾单位祖细胞发生黏附相互作用，其中尤以ITGA8-肾连接蛋白（nephronectin）最为显著，而这一相互作用对于恰当的微环境组织是必需的（
总之，MATCHY 为现有细胞生物物理表征技术提供了一种高通量且用户友好的扩展。MATCHY 为机械生物学研究和新兴组织工程策略提供了强有力的基准测试工具。这些策略旨在通过合成方式调控并利用自组织原理，以构建具有进一步发育潜能的复杂组织“种子”（
相对于通过细胞裂解或固定生成的松弛 TFM 凝胶状态所测得的 iPSC 细胞牵引力图（超过100个细胞，跨越
远端肾单位细胞（DN）和输尿管芽上皮（UB）由 GATA3
在进行 DN 诱导的前一天，将细胞以每孔 200k 个细胞的密度铺板前，先检查是否存在非目标分化。使用完全培养基培养细胞 24 小时，随后更换为添加补充剂的 TeSR-E6 培养基（TeSR-E6+）（STEMCELL Technologies 05946）和 7μM CHIR 99021（Tocris, 4423），培养 4 天。
第 5 天，将培养基更换为 TeSR-E6+、1 μg/ml 肝素（Sigma-Aldrich H4784）、600 ng/ml FGF2（PeproTech, 100-18B）和 1 μM CHIR，继续培养 3 天。第 8 天，将细胞按 1:1 比例传代至置于标准细胞培养箱（37°C、5% CO₂）中、放置于轨道摇床上并以 60 rpm 摇动的超低吸附 6 孔板（Corning, CLS3471）中。
对于 UB 诱导，在分化前一天，将细胞以每孔 50k 个细胞的密度铺于标准组织培养处理的 6 孔板中。24 小时后，使用 TeSR-E6+ 和 7μM CHIR 培养 4 天，随后使用 600 ng/ml FGF2 加 1 μg/ml 肝素培养 3 天，然后将细胞解离并重悬至 200k cells/μl。通过在 6 孔 Transwell 板上滴加 3 μl 细胞悬液制备细胞“pucks”，下室加入 1 ml 含 7 μM CHIR 的 TeSR-E6+。
孵育 1 小时后，将培养基更换为 600 ng/ml FGF2 加 1 μg/ml 肝素，继续培养 5 天，并每隔一天换液一次。随后将培养基切换为含 0.1 μM TTNPB（Tocris, 0761）的 TeSR-E6+，再培养 9 天；在此期间，下室加入 1 ml 培养基，并每隔一天更换一次。
GATA3-YFP+ 的 DN 和 GATA3-mCherry+ 的 UB 在分化结束时被解离并经 FACS 纯化。细胞悬液经 40 μm 细胞滤网过滤后，聚集并以 1ml cells/ml 重悬于含 2% FBS 的 PBS 中。使用 100 μm 喷嘴、约 600 events/s 的流速对阳性细胞进行分选。纯化结束后收集细胞，并重悬于 TeSR-E6+ 中，随后用于实验。
Madin-Darby 犬肾（MDCK）上皮细胞维持于最低必需培养基（MEM，Earle’s salts 和 L-glutamine，#MT10-010-CM，Corning）中，培养基补充 10% FBS 和 100 U ml
在进行用于收缩性表征的细胞接种之前，先用DPBS清洗MDCK细胞培养物1 min，随后以0.25%胰蛋白酶-EDTA处理10 min。使用完全培养基终止消化，并以300 g微量离心3 min使细胞沉淀聚集。将细胞悬液重悬至400,000个细胞/ml，每孔接种0.5 ml于8孔腔室载玻片中。为刺激pERK过表达，加入100 ng/ml可溶性重组人GFRA1（R&D Systems，AF714-SP）以及50 ng/ml重组人GDNF（R&D Systems，212-GD-010），处理12 hr。
ROCK抑制剂（STEMCELL Technologies，72304）和blebbistatin（Tocris，1852）处理浓度分别为10 µM和50 µM。
小鼠实验方案遵循NIH指南，并经宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准。按照定时妊娠方案从CD-1小鼠（Charles River）获取E17胚胎，并如前所述根据肢体解剖特征确认发育阶段（
免疫荧光染色和成像如前所述进行（
肾脏在35 mm玻底培养皿（FD35-100，World Precision Instruments）中成像，培养皿内放置一层厚约5 mm、配比为15:1（基质:交联剂）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体（Sylgard 184，2065622，Ellsworth Adhesives），并使用直径2 mm的活检冲孔器在其中制备孔洞。
成像使用Nikon Ti2-E显微镜进行，配备CSU-W1旋转盘（Yokogawa）、白光LED、激光照明系统（100 mW的405、488和561 nm激光器，以及75 mW的640 nm激光器）、Prime 95B背照式sCMOS相机（Photometrics）、电动载物台、4x/0.2 NA、10x/0.25 NA和20x/0.5 NA物镜（Nikon），以及载物台顶部环境控制罩（OkoLabs）。
原代胚胎小鼠肾发生完整微环境细胞悬液是在改良先前所述方案的基础上制备的（
如前所述，使用带有精确凝胶间距垫片的100 mm直径机械级硅片（University Wafer）进行制备（
标准显微镜载玻片经功能化处理以实现聚丙烯酰胺（PA）凝胶的共价附着，方法为先在1N氢氧化钠（NaOH，S8045，Sigma）中蚀刻15 min，再以3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯（440159，Sigma）、乙酸（EMD Millipore）和去离子（DI）水按2:3:5比例配制的溶液进行硅烷化处理，方式为将150 µL该溶液夹置于两张载玻片之间。该“载玻片夹层”在室温下孵育至少30 min，随后用100%甲醇和DI水冲洗。
将经硅烷化处理的一侧玻片面朝下放置于晶圆上的垫片之上。
PA 凝胶前体溶液通过依次移取以下组分配制：645.5 µL 去离子水、187.5 µL 丙烯酰胺溶液（40% w/v Acrylamide Solution，1610140，Bio-Rad）、100 µL 10× DPBS（14200075，Thermo Fisher Scientific）、35 µL N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联剂（2% w/v bis-acrylamide Solution，1610142，Bio-Rad）、20 µL 以去离子水按 1:100 稀释的荧光微球（FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 µm，660/680，F8807，Thermo Fisher Scientific）、6 µL 10% v/v 四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma）以及 6 µL 溶于去离子水中的 10% w/v 过硫酸铵（Sigma）。
由该前体形成的 PA 凝胶的杨氏模量为 6 kPa（
为使用 NHS 酯对凝胶表面未偶联的丙烯酰胺链进行衍生化，以实现黏附蛋白的功能化，将溶于 50 mM（pH 6.0）4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，40820004，bioWORLD）缓冲液中的 0.01%（w/v）N,N-亚甲基双丙烯酰胺与 0.09%（w/v）苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（LAP 光引发剂，900889，Sigma）以及 0.1%（w/v）丙烯酸混合-
来自原代组织或细胞培养板的细胞悬液（见
为读取牵引力，细胞在 1× DPBS 中用 4% 多聚甲醛（16% PFA，15710，Electron Microscopy Sciences）固定 20 min，并用 DPBS 清洗 4 次，每次 5 min。随后将孔板置于共聚焦显微镜上，并通过手动精细调整玻片四角进行全局配准，以对齐此前在全牵引状态下记录的相同位置。在校正全局平移和旋转位移后，相同的
对于后续免疫荧光实验，细胞在 1× DPBS 中用 0.5% v/v Triton X-100 透化 5 min，随后在 IF 洗涤缓冲液（1% w/v BSA、2% v/v Triton X-100、0.41% v/v Tween-20，EMD Millipore，1× DPBS）中含 1% BSA 的封闭液封闭 1 hr。
随后，将各孔与荧光团偶联的一抗孵育：第一组为兔抗-Six2（11562-1-AP，Proteintech，RRID: AB_2189084），标记Alexa Fluorphore 555（Novus，333-0010）；鼠抗-Lhx1（CF504527，OriGene，RRID: AB_2724601），标记Alexa Fluorphore 647（Novus，336-0010）；以及兔抗Cited1-488（Proteintech，CL48826999100UL，RRID: AB_2919211）。
另一组为兔抗-SIX2-555、鼠抗-LHX1-647，以及山羊抗-JAG1（AF599，R&D Systems，RRID: AB_2128257），标记Alexa Fluophore 488（Novus，332-0005）。所有一抗首先使用抗体纯化试剂盒（Novus，861-0010）进行纯化，随后根据说明书与荧光团偶联。所有偶联抗体均按1:50稀释，于4°C过夜孵育。随后，在避光条件下用IF缓冲液清洗细胞3次，每次1小时，并以150 nM DAPI复染细胞核15分钟。
F-肌动蛋白采用1X Phalloidin-555（Abcam，ab176756）于PBS + 1% BSA中染色1小时。最后，在进行抗体标志物的共聚焦免疫荧光成像前，用IF缓冲液和PBS分别清洗各孔1小时，使用20 µm
图像分析采用ImageJ/Fiji中的自动化宏程序进行（
接触角测定实验改编自Cerchiari
细胞在成像后立即固定并染色。相同的
解离的E17细胞以每孔50,000个细胞的密度接种于96孔超低吸附圆底板（Corning 7007）中，培养于Advanced RPMI 1640培养基和Glutamax中（见
采用Python实现的Cellular Potts Model（CPM）改编自Bao
该方程描述了细胞面积惩罚项（左项）、收缩性/皮层张力（中项）以及同型/异型黏附（右项）。各项定义见Bao
ωi：细胞所占据的晶格点x，y
相关细胞类型以相似的
由Combes中解离的E18.5小鼠胚胎肾脏scRNA-seq生成的基因表达矩阵
采用MATLAB进行单因素方差分析（ANOVA），并使用Tukey诚实显著性差异检验进行多重比较校正，同时进行配对和非配对
我们衷心感谢Gregory Dressler（密歇根大学）慷慨赠予MDCK-RET9细胞。感谢John Viola和Samuel Grindel在实验方案和球体分割方面分享其专业经验。本研究部分工作在宾夕法尼亚大学Singh纳米技术中心完成，该中心由NSF国家纳米技术协调基础设施项目（NNCI-2025608）支持。本研究部分获得NSF通过宾夕法尼亚大学材料研究科学与工程中心（MRSEC，DMR-2309043）的资助。
本研究还获得NSF GRFP奖学金（JL）、NIH F32 DK126385（LSP）、NIH NIGMS MIRA R35GM133380（AJH）、NIH NIDDK R01DK132296（AJH）以及NSF CAREER奖（2047271，AJH）的支持。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.02.07.579368
🏷️ 细胞黏附 牵引力测量 组织形态发生 肾单位发育 高通量筛选