基于干细胞的胚胎模型是研究早期胚胎发生的有前景的替代方案。我们引入了两种不同的模型，以复制小鼠胚胎发育过程中胚外内胚层与上胚层之间的动态关系。诱导型
小鼠着床前发育的特征是两次细胞命运决定，每次都会导致谱系分离[
基于干细胞的胚胎模型已成为研究哺乳动物胚胎早期发育的有吸引力的替代方案，但它们并非没有局限性。小鼠整合性胚胎模型，如 blastoid[
在此，我们详细介绍了采用两种方法稳健生成类似内细胞团结构的过程：诱导型的聚集
为了形成一种具有生成 PrE 和上胚层潜能的双潜能内细胞团细胞，我们构建了诱导型（i
A. 用于构建 i 的 DNA 构建体示意图
在持续表达 Cherry 阳性的 ES 细胞系扩增后，对正确靶向的克隆进行了检测，以评估
早期囊胚（E3–E3.25）的内细胞团细胞尚未决定命运，并且由于其共表达，具有形成 PrE 或上胚层的潜能
不依赖 Hippo 的位置依赖性 PrE 发育及细胞分选促进了 PrE 在 i 两者周边的定位
A. 对影响 Hippo 通路活性的小分子在位置依赖性 PrE 发育中的影响进行评估。i
关于早期囊胚内细胞团由随机混合的细胞组成，且这些细胞显示不同水平的 GATA6 或 NANOG 表达的观察结果，对“位置是决定细胞命运唯一因素”的假说提出了挑战[
为了检验内细胞团中的这种功能性细胞分选是否可以被建模[
A. 柱状图显示，与初始 ES 细胞相比，第 1–2 天 ICM 类胚体中 Cherry 阳性细胞的前 50 个上调基因所富集的 Reactome 通路。柱子的颜色基于与各通路相关的上调基因数量。B. 初始 ES 细胞与 ICM 类胚体（第 1–4 天）scRNA-seq 数据的整合。UMAP 图显示了标准化表达的
来自初始状态 ES 细胞以及在 ICM 类胚体中聚集后的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据表明，这两类细胞群体具有两条不同的发育路径（
E3.5 的内细胞团呈现上胚层与 PrE 已决定细胞的“盐和胡椒”式分布，而从 E4.5 开始，这些细胞发生分选，由 PrE 覆盖初始上胚层[
通过拟时序和 RNA 速度分析确定的 EGFP 阳性细胞发育轨迹，与在连续天数收集的 ICM 类胚体中观察到的上胚层发育连续阶段相对应（
A. 初始 ES 细胞与 ICM 类胚体（第 1–4 天）scRNA-seq 数据整合的 UMAP 图，按鉴定的簇着色，箭头表示 RNA 速度。B. 显示标准化表达的 UMAP 图
A. 以相对拟时序着色的 UMAP 图，显示 Cherry 阳性簇中原始内胚层和胚外内胚层的发育、数据集组成、采用 Louvain 方法鉴定的簇，以及归一化表达
我们对 ICM 类胚体中源自 PrE 细胞的拟时序轨迹分析揭示了若干关键的 DVE/AVE 标志物的存在（
ICM 类胚体内源自 PrE 和上胚层的谱系发育轨迹受多种细胞间相互作用调控，如 CellPhoneDB 所预测[
A. 热图显示 CellPhoneDB 在每天各细胞类型之间鉴定出的显著发送相互作用数量。B-C. 点图显示在 EGFP（B）或 Cherry（C）谱系中至少一种组合内显著的 CellPhoneDB 相互作用，并按通路排序。仅显示该谱系中至少具有 3 个显著相互作用的通路。点的大小和颜色分别表示平均相互作用评分，显著点以黑色边框突出显示。
A. 点图显示按通路分组的 ICM 类胚体中跨膜基因的归一化表达。颜色表示归一化基因表达，而点的大小反映表达该基因的细胞百分比。B. 点图显示按通路分组的 ICM 类胚体中效应基因的归一化表达。C. 点图显示按通路分组的 ICM 类胚体中受体的归一化表达。D. 点图显示图中所示胚胎簇内若干通路效应基因的归一化表达
根据我们对效应基因的评估，ICM 类胚体第 2 天上胚层中从 naïve 多能性退出伴随着 JAK/STAT 信号的下降（
基于效应基因的表达
在小鼠胚胎的 primed 上胚层中，NODAL 维持不足或暴露于 BMP4 会阻碍原条形成所必需的 WNT 信号上调[
ICM 中上胚层和 PrE 的形成依赖于位置线索和细胞分选动态。随后，上胚层在进一步发育过程中获得前后轴之前，会先从 naïve 多能状态转变为 primed 多能状态。然而，由于植入期间胚胎脆弱且体积微小，难以在不损伤的情况下将其从子宫中分离，再加上当前小鼠整合型胚胎模型（如 blastoids）的局限性，研究这一发育阶段具有挑战性[
根据拟时序分析，我们的 ICM 类胚体中源自 PrE 的谱系其默认发育状态似乎为 DVE/AVE。DVE/AVE 的建立及其局限于特定区域依赖于 NODAL 与 BMP 信号之间的动态平衡[
除提供一种稳健的、非整合型的基于干细胞的胚胎模型用于研究发育外；ICM 类胚体还为改进 ETX 类胚体的构建提供了有价值的见解。去除 i
总之，所观察到的相似性介于
小鼠ES细胞的建立与培养按照先前描述的方法进行[
细胞收集后储存在裂解缓冲液中（Promega ReliaPrep RNA Cell Miniprep，货号z6012），于-20°C保存直至进一步处理。解冻后，按照生产商说明书，使用试剂盒（Promega ReliaPrep RNA Cell Miniprep，货号z6012）分离RNA，并以50 µl水洗脱。总计取500–1000 ng RNA，按照生产商方案，使用随机六聚体引物和Superscript III逆转录酶（Thermo Fisher，货号18080093）逆转录为cDNA。
将cDNA以水稀释（1:5）后，使用BioRad CFX384实时PCR仪检测表达水平。10 µl反应体系包含2× SYBR Green PCR Master Mix（Promega，GoTaq qPCR Master，货号A6002）、2 µM引物和1 µl稀释后的cDNA。反应首先在95°C保温10 min，随后进行40个循环：95°C 30 sec，60°C 1 min。所使用的实时PCR引物序列见
ICM类胚体以4%多聚甲醛固定20 min，在PBS中清洗（3×5 min），随后用PBS中0.25% Triton X-100通透处理20 min，再以PBS清洗（3×10 min），并于4°C在封闭液（PBS中0.5% BSA、1% Tween-20）中孵育过夜（最长可达1周）。封闭后，ICM类胚体于4°C用以封闭液稀释的一抗孵育过夜。随后在封闭液中清洗（3×10 min）后，于4°C继续用以封闭液稀释的二抗孵育额外2天。
2天后，ICM类胚体在PBS中漂洗（3×10 min），首次清洗时加入Hoechst33342至终浓度20 ug/ml。随后将ICM类胚体包埋于Matrigel液滴中，并使用配备HCX APO 20×水浸物镜的Leica SP5活体显微镜进行成像。图像使用ImageJ处理。所使用的抗体见
单细胞按照生产商方案，使用10X Genomics Chromium平台和Chromium Next GEM Single Cell 3′ Reagent kit v3.1双索引试剂盒（10X Genomics）进行处理。简而言之，每个芯片通道中加载15,000个细胞，将其分隔为乳液凝胶珠（GEMs）。在GEMs内，细胞裂解，随后对RNA进行带条形码的逆转录。GEMs破乳后，进行扩增、片段化以及接头和样本索引的添加。
文库合并后，在Illumina NovaSeq6000仪器上以28-10-10-90循环进行测序，目标是每个细胞至少达到25,000条原始reads的测序深度。
不同天数细胞的整合使用scanpy v1.9.1进行[
我们对第1天和第2天的Cherry阳性细胞与Naive细胞之间进行了差异表达分析，以揭示发育过程中被激活的基因。使用Seurat的FindMarkers函数（min.pct=0.1，logfc.threshold=0.1）鉴定差异表达基因（DEGs），并筛选出上调基因。排名前50的DEGs随后使用EnrichR v3.2进行通路分析[
使用CellphoneDB v5.0鉴定了不同细胞组之间（即按天数和谱系划分的细胞）的细胞—细胞相互作用[
基于文献研究，我们为多个通路选择了已知的效应分子、配体和受体，这些通路包括JAK/STAT、WNT、ACTIVIN/NODAL、MAPK、Hedgehog、NOTCH和BMP。采用点图对各谱系在每日的这些已知基因表达进行了可视化。对于每条通路，我们计算了各谱系每日的平均表达量，并将这些数值转换为z分数。对每个谱系分别将这些分数以随时间变化的图示形式进行可视化，其中不同天数之间的差异以梯度表示。
来自ETX胚样体的scRNA-seq数据按照先前所述方法进行了预处理[
来自胚胎、类囊胚和干细胞的整合scRNA-seq数据集下载自Posfai等，2021（GSE145609）[
此外，对Nowotschin等，2019（GSE123046）的scRNA-seq数据进行了重新分析[
本研究得以开展，得益于授予JG的ZonMW-PSIDER资助（10250022120002）。
撰写、审阅与编辑：CD、BT、OS、SM、DH、JG
作者声明不存在竞争性利益。
本研究生成的所有原始和处理后的scRNA-seq数据均已提交至NCBI Gene Expression Omnibus（GEO），登录号为
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📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.28.630545
🏷️ 小鼠胚胎模型 内细胞团类胚体 原始内胚层 上胚层 细胞命运决定 早期胚胎发育