人胚胎干细胞系的建立证明嵌合胚胎能够进行自我校正
Chuyu Li、Jiazi Xie、Juan Dong、Chao Gao、Meng Xia、Yuting Lin 等 3 位作者
这是一篇预印本；尚未经过期刊同行评议。
https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1558669/v2
本作品采用 CC BY 4.0 许可协议授权
低水平嵌合现象是人类早期发育的常见特征。尽管嵌合胚胎可能导致健康活产，但嵌合现象的直接影响尚不明确。虽然在小鼠模型中已证明胚胎具有自我校正能力，但在人类中，仅能通过延长培养来研究染色体异常和囊胚嵌合现象对着床前后早期阶段的影响。
按照既定培养方案建立胚胎干细胞。通过 PGT-A 检测到 24 枚高质量嵌合/非整倍体嵌合囊胚。分离的内细胞团（ICMs）被接种于无饲养层培养皿中，培养 10–12 天后，共获得 6 个来源于囊胚 ICM 的干细胞克隆。在干细胞生长过程中脱落的细胞被收集，并对干细胞及脱落细胞进行二代测序。为检测多能性，分离少量干细胞并进行传代培养。
根据干细胞脱落细胞和干细胞的二代测序结果确认了 PGD 状态；5 枚囊胚中的嵌合现象已被完全修复，而 1 枚囊胚中的嵌合现象仅被部分修复。同时，通过免疫荧光、流式细胞术和……验证了这些细胞具有多能性以及向三个胚层分化的能力。
人类嵌合/非整倍体嵌合囊胚可通过清除嵌合细胞实现自我校正。
嵌合胚胎是指在植入前胚胎中共存有两种或以上核型不同的细胞系的胚胎。国际植入前遗传学诊断学会（PGDIS）规定，异常细胞比例为 20% 至 80% 的胚胎为嵌合体，>80% 为非整倍体，<20% 为整倍体[
胚胎嵌合现象可影响胚胎发育潜能，导致种植失败、流产以及异常胎儿的出生[
基于这一假设，我们分离人类囊胚的内细胞团（ICMs）以建立能够长期稳定自我更新并具有多向分化潜能的胚胎干（ES）细胞系[
本研究使用了经 PGT-A 判定为染色体异常的胚胎。本研究中人类囊胚的应用已获南京医科大学第一附属医院机构伦理委员会批准。本研究的所有方法均按照相关指南和法规执行。所有参与者均年满 18 岁，并签署了书面知情同意书。
我们使用了南京医科大学第一附属医院生殖医学中心在PGT-A后捐赠的高质量囊胚，共纳入13名患者的24枚胚胎（母亲年龄29±7岁）进行研究。所有胚胎均接受了标准的
对于经PGT-A检测为A的胚胎，使用玻璃针小心分离胚胎滋养外胚层和内细胞团。细胞在含5% CO
将少量经消化的人胚胎干细胞（hESCs）克隆接种于预先准备好的24孔板盖玻片上。细胞培养4天后，在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟，并用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗3次。固定后，将细胞浸没于100 µl 0.4% TritonX-100/DPBS中，于冰上裂解10分钟，并用DPBS清洗。加入5% BSA（200 µl/孔），将培养板置于37°C培养箱中封闭30分钟。加入一抗后，于4°C过夜标记细胞。
所用一抗为兔抗OCT4（1:200，Abcam）、兔抗Nanog（1:200，Cell Signaling Technology）、小鼠抗SSEA4（1:200，Abcam）以及小鼠抗TRA-1-60（1:200，Cell Signaling Technology）。用DPBS清洗3次以去除一抗后，加入二抗，在室温避光孵育1小时进行标记。
所用二抗为驴抗兔IgG（H+L）（1:1000，Thermo Fisher Scientific）和驴抗小鼠IgG（H+L）（1:1000，Thermo Fisher Scientific）。在载玻片上滴加20 µl封片/封闭液后，用弯针挑起小圆片并翻转，使其倒置于载玻片上。使用荧光倒置显微镜观察并记录细胞显微图像。
收集细胞，并将其密度调整为1.0 × 10
采用IV型胶原酶和中性蛋白酶消化hESCs，收集细胞克隆并置于超低吸附培养皿中进行悬浮培养。形成一种称为胚样体（EB）的小型球状细胞团。随着培养天数的增加，EB逐渐增大，表面变得更加光滑。在分化第0、3、7和14天收集EB，加入1:1混合的0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶，于37°C水浴中孵育5分钟，孵育期间每1分钟混匀一次。消化细胞黏附分子以获得单细胞后，将其接种于Matrigel包被的小圆片上，在培养箱中培养24小时后，用4% PFA固定，并通过免疫荧光进行检测。
干细胞gDNA的全基因组扩增及二代测序
采用多重退火 SurePlex DNA 扩增试剂盒（Illumina：目录号 F1006000900）按照制造商说明书对干细胞来源的基因组 DNA（gDNA）进行扩增。随后，按照 Veriseq DNA 文库制备试剂盒（Illumina；F1006001002，F1006001002）的操作流程构建用于 NGS 的测序文库，并在 Illumina MiSeq 平台（Illumina, San Diego, CA, USA）上进行测序。
通过 NGS 对干细胞进行遗传筛查以鉴定核型和拷贝数变异
沿 24 条染色体以 4 MB 为 bin 大小统计 reads 数，并以所有样本中对应 bin 的平均值进行归一化。我们早期的预实验数据表明，reads 在染色体上的均匀分布提示染色体内容物的靶向情况及细胞核型。染色体拷贝数分析流程按照先前报道的方法进行[
共使用了 13 枚患者来源的嵌合/非整倍体嵌合胚胎，且均经诊断为 PGT-A。共培养了 24 个囊胚，所有囊胚在分离内细胞团（ICM）之前均进行了滋养外胚层活检。分离后的 ICM 接种于涂覆 Matrigel hESC-Qualified Matrix（Corning, USA）的培养板上，10–12 天后获得了 6 个 ES 细胞克隆。囊胚形态学评分、表型、囊胚 NGS 结果及其对应的细胞碎片和干细胞克隆形态见表 1。
在形成干细胞克隆的 6 枚胚胎中，有 2 枚为嵌合囊胚，其脱落细胞碎片中所有染色体均表现为嵌合，而形成的干细胞克隆则为整倍体（胚胎 A、B）。此外，在 4 枚非整倍体嵌合囊胚中，3 枚发生了嵌合修复（胚胎 C、E、F），1 枚发生了部分嵌合修复（胚胎 D），但在脱落的细胞碎片中仅检测到 1 个嵌合细胞（胚胎 D）。同时还检测了染色体嵌合性的存在：1 枚非整倍体嵌合囊胚已实现完全修复，包括其非整倍性在内（胚胎 F）。
在显微镜下观察时，可见 hESCs 呈克隆性生长，形成边界清晰、结构致密的多细胞集落。细胞排列紧密，具有较高的核质比和明显的核仁。健康的集落无缝融合为紧密的细胞簇，中心区域具有多层细胞。免疫荧光和流式细胞术分析显示，hESCs 高表达干细胞标志物 OCT4、NANOG、SSEA4 和 TRA-1-60。该
在本报告中，我们描述了嵌合/非整倍体嵌合的 ICM 的形成
本研究探讨了嵌合胚胎在发育过程中是否能够对其染色体进行自我修复。与先前研究不同，这些胚胎仅
用于 PGT-A 的新型诊断技术，即可在单细胞水平检测胚胎非整倍体的快速低深度全基因组二代测序方法的发展，导致了有关胚胎嵌合体现象报道的增加[
已知嵌合现象的发生率会随着发育进程而降低，并且在囊胚中的发生频率低于卵裂期胚胎[
来自嵌合小鼠模型的植入前胚胎被发现其非整倍体细胞呈进行性减少。由整倍体细胞和非整倍体细胞组成的嵌合体在内细胞团（ICM）中表现出非整倍体细胞的选择性凋亡，而在滋养外胚层（TE）中的非整倍体细胞则表现出增殖缺陷，从而导致自囊胚阶段开始非整倍体细胞的进行性耗竭[
2019年，Popovich等人应用二代测序研究了经扩展
然而，染色体异常检测方法仍然导致囊胚嵌合体在临床上具有显著发生率，因为 PGT-A 将活检中平均5–6个细胞的染色体组成视为代表整个胚胎，这也由此引发了争议。Gleicher 等人使用数学模型提出，嵌合细胞在滋养外胚层中呈均匀分布，且活检中至少需要27个滋养外胚层细胞，才能代表整个囊胚的核型[
本研究的发现加深了对人类嵌合囊胚自我纠正能力的认识。用于建立干细胞的 ICM 分离方法为胚胎通过非整倍体细胞凋亡实现自我纠正提供了直接证据。这些发现可为辅助生殖中的嵌合胚胎选择提供参考
本研究已获得南京医科大学伦理委员会批准（2012-SR-128）
本研究中使用和/或分析的数据集可在合理请求下向通讯作者获取。
作者声明，不存在任何已知的竞争性经济利益或可能对本文所报告工作产生影响的个人关系。
本研究获得国家自然科学基金（81730041，81671447）及国家重点研发计划（2021YFC270050，2017YFC1001301）资助。作者声明不存在竞争性利益。
CL 设计了研究，实施了实验，分析了数据，并撰写了手稿。JX 和 CG 参与了全基因组扩增和二代测序。JD 协助建立了干细胞系。MX 和 YL 参与了胚胎培养和 PGT-A。YC、LQ 和 WW 对论文进行了重要修改。所有作者均参与了结果解释并审阅了文章。
生殖医学国家重点实验室，南京医科大学第一附属医院生殖医学临床中心，南京医科大学，江苏南京 210029，中国
表1. 囊胚PGT-A、其对应的细胞碎片及hESC的外观和NGS结果
+4（嵌合，34%）、+6（嵌合，38%）、+14（嵌合，44%）、+Y（嵌合，29%）
-7（p22.3-p11.2）（嵌合，37%，57.60Mb）、-13（q12.11-q34）（嵌合，30%，95.49Mb）
+8（p12-qter）（嵌合，67%，114.96Mb）、+19（嵌合，41%）、+20（嵌合，36%）；-5（q14.3-qter）（嵌合，35%，93.10Mb）、-22（q11.21-q13.33）（21.36Mb）
+8（p12-q24.3）（114.96Mb）、-22（q11.21-q13.31）（28.96Mb）
+8（p12-q24.3）（115.56Mb）、-22（q11.21-q13.31）（28.96Mb）
+1（q32.3-qter）（34.63Mb）、+13（q12.11-q12.3）（嵌合，50%，12Mb）；-11（q13.3-qter）（嵌合，38%，65.14Mb）、-13（q12.3-qter）（嵌合，26%，83.02Mb）
+1（q32.3-q44）（34.63Mb）、+11（p15.5-q13.4）（嵌合，39%，73.91Mb）、-11（q13.4-q25）（嵌合，40%，60.97Mb）、-13（q13.1-q34）（嵌合，63%，82.29Mb）
+1（q32.3-q44）（34.63Mb）、-11（q13.4-q25）（嵌合，48%，60.97Mb）、-13（q21.33-q34）（嵌合，50%，45.09Mb）
+2（p11.2-qter）（嵌合，29%，154.78Mb）、+21；-2（pter-p11.2）（嵌合，36%，86.53Mb）
Research Square 可让您尽早分享研究工作，获得社区反馈，并在提交期刊同行评审前开始修改您的稿件。
作为 Research Square Company 的一个部门，我们致力于使科研传播更快速、更公平且更具实用价值。我们通过为全球科研界开发创新软件和高质量服务来实现这一目标。我们不断壮大的团队由研究人员和行业专业人士组成，携手解决科学出版所面临的最关键问题。
© Research Square 2026 | ISSN 2693-5015（网络版）
📄 原文链接：https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1558669/v2
🏷️ 人胚胎干细胞 嵌合胚胎 自我校正 囊胚 内细胞团 染色体异常