人類世生物多樣性喪失的危機要求我們開發用於研究非模式生物的新工具。例如，大象既是瀕危物種，也是研究體型、社會行為和壽命等複雜表型的優良模型，但它們仍然嚴重缺乏研究。本文在此報告首次獲得大象（
在過去的1萬年中，人類對世界生態系統產生了深遠影響。人類幾乎徹底改變了世界上每一種生態系統的生態格局，並且很可能至少對全球超過三分之二陸生巨型動物群的滅絕負有部分責任[
直到過去十年，這些努力中的大多數仍具有操作性，但近年來，多個研究團隊已開始考慮將生物技術作為一種保護工具[
這些保護與“滅絕復活”工作流程的一個關鍵組成部分是誘導多能幹細胞（iPSCs）的生成。iPSCs在分子和表型特徵上與胚胎幹細胞（ESCs）相似，並且原則上可以被轉化為生物體內任何其他類型的細胞——包括“滅絕復活”和保護所需的胚胎細胞。iPSCs最初是由小鼠的體細胞獲得的[
一旦獲得每個物種的iPSCs，人們便能夠開啟理解其生物學並通過工程手段促進其存續或重生的大門。近年來，幹細胞生物學家已經利用幹細胞進行細胞命運工程，將其分化為多種不同類型的細胞，用於治療或診斷目的[
除其生態相關性之外，大象還具有非常有趣的生物學能力——它們高度聰明[
在對更為傳統的重編程方法進行全面篩選但未獲成功之後，研究人員通過採用基於化學的小分子多能性培養基並結合克隆挑選擴增，隨後過表達關鍵多能性轉錄因子OSKM(LN)和癌基因SV40LT，和/或使用針對大象
除了依賴轉基因的方法之外，我們還探索了一組日益發展的、無需使用轉基因的化學重編程方法。我們測試了一組已發表的雞尾酒配方[
正是通過整合這兩類方法，才實現了首次生成
在建立起更為典型的幹細胞形態之後，我們進一步開展了全面的幹細胞表徵。我們通過免疫熒光（IF）證明，我們的細胞表達核心多能性蛋白（
儘管我們成功地對我們的emiPSCs開展了大量分子和功能檢測，但有趣的是，我們並未觀察到
在確立了對內源性表達的增強之後
我們的 emiPSC 表達多種幼稚態多能性標誌物，並且能夠通過胚樣體分化和畸胎瘤形成分化為三個胚層。在確認核心多能性標誌物的表達後，我們希望評估這些細胞的基本生長特性和染色體正常性。為此，我們採用了簡單的細胞核分離、裂解和染色體計數方法，以確認我們的細胞確實具有預期的染色體數目 56/56（
接下來，我們希望檢測經典上在預備態與幼稚態 iPSC 中表達的基因的表達情況，並確定我們的細胞更接近預備態還是幼稚態。我們觀察到，與其他物種中的幼稚態細胞更常相關的形態特徵在我們的細胞中有所體現，並且幾乎未觀察到自發分化（
由於我們的 emiPSC 細胞系表現出符合預期的幹細胞分子和表型特徵以及正常核型，因此我們進一步探究其分化潛能。首先，我們進行了胚樣體（EB）形成實驗。我們證明，所有細胞系均可在 5–7 天內形成 EB，且其中包含表達來自三個胚層各自早期分化標誌物的細胞—
在確認 EB 中存在許多預期的早期分化標誌物後，我們進行了三胚層分化實驗，以驗證各自譜系中標誌基因的存在。我們觀察到，與其來源的 emiPSC 細胞系和 emEC 相比，這些分化細胞中的早期分化標誌物通過 RNA-seq 表現出上調（
鑑於我們的 iPSC 細胞系能夠形成 EB 並分化為早期三個胚層，我們進一步測試了這些細胞系是否能夠形成畸胎瘤。儘管該實驗可能存在混雜因素，並且其是否出現在數據集中往往取決於研究人員，這很可能是因為該實驗通常難以標準化[
在建立我們的 iPSC 細胞系並確認其分化能力後，我們對其與一組來源廣泛的其他哺乳動物幹細胞進行了比較分析[
對多個物種的 RNA-seq 數據進行了比較。
在這裏，我們展示了首個有文獻記載的、成功生成大象誘導多能幹細胞的方案。我們的方案需要複雜的化學培養基配方以實現原代細胞的部分重編程，並需要大象特異性的核心多能性因子以及對細胞生長通路的調控來實現完全重編程。此外，我們還驗證了 emiPSC 的核型完整性，測定了其較高的生長速率和可忽略不計的自發分化率，並確定這些細胞顯著上調了許多幼稚態多能性標誌物以及部分經典預備態標誌物。
隨後，我們對這些 emiPSC 系進行了功能表徵，並證明其能夠形成胚樣體（EBs）並分化為三個胚層。目前，正在開展進一步的 EB 免疫染色工作，以解析 EB 的三維結構（即二維成像切片），並結合更多標誌物進行分析。對於三胚層分化細胞的免疫熒光（IF）結果，現有成像、RNA 測序（RNA-seq）和即時定量逆轉錄 PCR（RT-qPCR）數據均證實，在這些實驗中存在早期分化標誌物。隨後，我們進一步表明，這些細胞系也能夠形成包含多樣細胞類型群體的畸胎瘤，提示其具有分化潛能。
鑑於畸胎瘤在體內的生長動態存在差異（甚至可長達 12 周），我們正在通過獨立注射和更長期監測，並隨後收集樣本進行分析，以進一步驗證其分化潛能。有趣的是，裸鼴鼠具有抗癌特徵，並且與大象共享某些細胞週期調控異常（上調
本研究首次成功報道了 emiPSC 的製備，並標誌着後續更多研究工作的開始。進一步分析……的意義
重編程持續時間方面，鼠等模式生物通常為 5–10 天，包括人類在內的大型哺乳動物通常超過 3 周，而亞洲象則更長，達到 2 個月。我們正在進一步探索，是否可通過替代策略緩解本研究中觀察到的較長重編程過程。例如，在關於裸鼴鼠 iPSC 建立的研究中［
對一組多樣化哺乳動物 iPSC 的比較分析顯示，我們的細胞似乎與其他大型體型哺乳動物聚類最為接近。然而，不同物種間在多能性標誌物表達和分化潛能方面觀察到的差異，值得進一步深入研究，以明確這些現象究竟源於重編程方法還是物種差異。例如，最初相對較低表達的
出於保護目的和配子發生研究的需要，驗證真正的初始態（naïve）iPSC 是關鍵一步。探索象幹細胞所具有的、為大象所特有的特徵，以及賦予細胞來源胚胎發育模型……的能力
生物樣本庫建設中的要求，例如新近分離獲得的細胞以及親本細胞譜系的選擇，也可預測重編程的成功結果，從而進一步夯實保護流程的基礎。在本研究之後，進一步從長鼻目現存所有物種和亞種中建立 iPSC，對於其保護以及理解這些標誌性巨型食草動物之間的相似性與差異性至關重要。
RNA 提取使用 RNeasy Plus Universal Mini Kit（Qiagen 73404）進行。RNA 製備完成後，RNA 樣本直接送至 NovoGene 進行外部質量控制（QC）和樣本測序。對於 ATAC-seq 樣本，將冷凍細胞沉澱送至 NovoGene，所有實驗、文庫製備和測序均由 NovoGene 完成。
RNA-seq分析使用Form Bio平台上的RNASeq工作流中的表達分析模組進行。首先使用TrimGalore對測序讀段進行修剪，以去除低質量（qual < 25）的讀段末端，並去除長度小於35 bp的讀段。修剪後的讀段使用STAR2（預設）或HiSAT比對至參考基因組。對於同一樣本由多次運行生成的BAM文件，使用Samtools進行合併。轉錄本和基因的丰度分別使用FeatureCount生成原始基因計數，使用StringTie生成FPKM，使用Salmon生成原始轉錄本計數。
樣本間比較以及基因/轉錄本差異表達分析使用EdgeR、DESeq2和IsoformSwitchAnalyzeR進行。ATAC-seq分析採用類似的工作流程。具體而言，首先使用TrimGalore對讀段進行修剪，以去除低質量（qual < 25）的讀段末端，並去除長度小於35 bp的讀段。該工作流程可使用原生開源工具（NOST）或Parabricks運行。採用NOST時，修剪後的讀段使用BWA mem或Minimap2比對至參考基因組。
對於同一樣本由多次運行生成的BAM文件，使用Samtools進行合併。比對質量使用FastQC、Samtools和Bedtools進行評估。採用Parabricks時，使用fq2bam對修剪後的讀段進行比對、標記重複讀段並評估比對質量。質量指標使用MultiQC進行彙總。MA圖使用DESeq2（v3.18）和ggpubr（v0.6.0）生成。
人類、狨猴、小鼠、兔、牛和犀牛的公開RNA-seq數據[
EB採用4% v/v多聚甲醛（15710，Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA，USA）固定20 min，清洗3次後，用0.5% Triton X-100（Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO）透化20 min。樣本再清洗3次後，使用5% BSA、0.05% Triton封閉1 h，並於4°C下在含1% BSA、0.05% Triton-X100的抗體稀釋液中與一抗孵育過夜。
樣本清洗3次後，於37°C下與二抗孵育1 h，隨後清洗3次，並在室溫下用Hoechst 33342（H1399，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）復染10 min，再清洗3次並使用Vectashield（Vector Labs.，H100010A）封片。顯微圖像使用Zeiss AxioObserver .5 LED熒光顯微鏡、高性能顯微成像相機Axiocam 705 mono R2採集，物鏡為LD A-Plan 10X/0.25 Ph1。
emiPSC使用定製的大象特異性抗體進行染色，用於
胚樣體（EBs）採用 AggreWell 400 板（StemCell 34450）或超低吸附 96 孔板（Corning 4515）形成。平板預先用 Anti-Adherence Rinsing Solution 進行預處理，隨後加入上述重編程培養基中的細胞：對於 AggreWell 400，每個微孔約加入 400 個細胞；對於 96 孔板，每孔加入 5k 個細胞，並以 100g 離心 3 min。接種後的細胞在 37C、5% CO2 和 95% 濕度條件下靜置培養 24 h。
24 h 後，在不擾動細胞的情況下，每 48 h 更換一次培養基，使用 AggreWell EB Formation Medium（StemCell 05893）或重編程培養基，隨後進行 IF 和成像。
將 50,000 個 emiPSC 接種於經 Laminin521 包被的 12 孔板上，並使用 STEMdiff Trilineage Differentiation Kit（StemCell 05230）處理 10 天。
染色體分離和計數通過將細胞在 37C 下孵育 3 h 進行。隨後，將細胞重懸於 37C 的 0.075M KCl 溶液中 8 min。接着，將細胞重懸於 1 ml 固定液中，輕輕混勻，並在室溫（RT）下孵育 10 min。隨後以 900 rpm 離心 8 min，並將細胞重懸於固定液中，在 RT 下孵育 10 min。該固定步驟重複兩次。最後，將細胞加染料後裝載於載玻片上進行成像。
將 200,000–1,000,000 個 emiPSC 注射至免疫缺陷小鼠後肢。連續 6 周每日觀察腿部情況，之後取出腫瘤團塊。畸胎瘤切片由 Histowiz 的專業組織學家進行評估。
概念設計，E.H.；方法學，E.H. 和 E.A.；正式分析，E.A.、K.H.、C.R.C.、Y.T.、K.B.、C.R.I.、N.K.、H.B.、X.A.P.、J.N.s、A.K.、B.C. 和 E.H.；研究實施，E.A.、K.H.、C.R.C.、Y.T.、A.A.T.、K.B.、C.R.I.、N.K.、H.B.、X.A.P.、A.Q.、G.R.、G.K.、M.M.、N.M.、K.Z.、J.K.、A.B.、B.M. 和 E.H.；資源提供，B.L. 和 G.C.；數據整理，E.A.、Y.T.、K.B. 和 C.R.I.；寫作，E.A. 和 E.H.；可視化，E.A. 和 E.H.；監督指導，E.A.、B.C.、B.L.、G.C. 和 E.H.；項目管理，E.A. 和 E.H.；經費取得，B.L. 和 G.C.。
E.H.、K.H.、C.R.C.、B.L. 和 E.A. 是關於象 iPSC 使用的專利及專利申請的發明人，該等專利由 Colossal Biosciences 持有。E.H.、K.H.、C.R.C.、C.R.I.、N.K.、H.B.、X.A.P.、G.R.、G.K.、M.M.、N.M.、K.Z、J.K.、A.B.、B.M.、B.C.、M.J.、B.L.、G.C. 和 E.A. 為 Colossal Biosciences 的股東。
E.A.、C.R.C.、K.B.、X.A.P.、B.M.、A.K.、A.B.、B.M.、B.C.、M.J.、B.L.、G.C. 和 E.H. 為 FormBio 的股東。Y.T. 與 Colossal Biosciences 簽有涉及現金/股票的諮詢協議。G.C. 是 Colossal Biosciences 及其他公司的創始人和股東——有關 G.C. 的完整利益披露見於
作者謹此感謝 Beth Shapiro 對本稿提出的寶貴意見，並感謝 Colossal Biosciences 科學顧問委員會、保護顧問委員會、執行顧問委員會以及核心執行領導團隊成員在本項工作中所開展的交流與提供的支援。我們同時感謝 Colossal 的全球學術與產業合作伙伴。我們感謝 BioRender 提供可視化支援，並感謝 AbClonal 進行定製抗體設計。
補充添加了額外的補充數據，並對正文中的部分表述進行了修改。
感謝您有興趣幫助傳播 bioRxiv 的相關資訊。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.05.583606
🏷️ 誘導多能幹細胞 大象 幹細胞建立 瀕危物種保護 非模式生物