經微圖案化的人多能幹細胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）經BMP4處理後形成的體系（2D gastruloids）是目前應用最廣泛的人類原腸胚形成幹細胞模型之一。由於其簡便性和可重複性，該體系非常適合用於組織圖案化的高通量定量研究，並由此推動了我們對哺乳動物原腸胚形成機制的諸多認識。然而，2D gastruloids此前僅被研究至48小時。在本研究中，我們將該體系延長至96小時。
我們發現了一個高度可重複的形態發生階段，在此期間，源自原條樣區域的定向遷移形成了位於上胚層樣層下方的中胚層層。多種類型的中胚層以顯著的空間組織方式產生，包括位於集落邊界的側中胚層樣細胞以及位於集落更內側的旁軸中胚層樣細胞。單細胞轉錄組學顯示，這些細胞與人類及非人靈長類胚胎中的中胚層具有很強的相似性。然而，我們的數據提示，參考人類胚胎的註釋可能需要修訂。這表明，對2D gastruloids進行延長培養可為研究人類中胚層分化與形態發生提供一種強有力的模型。
中胚層是胚胎三胚層之一，在原腸胚形成過程中通過自原條遷移而形成，並且對於身體體式的建立至關重要。
2D gastruloids是最早建立的人類原腸胚形成幹細胞模型之一。
我們發現，如果通過在微圖案上培養24小時以確保足夠高的初始細胞密度，然後再進行BMP4處理（見方法），則2D原腸胚樣體在4天培養過程中仍能保持高度有序。在原腸胚樣體平面（xy）內，48小時的“經典”標誌物——羊膜樣細胞的ISL1、原條的BRA、上胚層的SOX2——在72小時和96小時仍然存在，且組織方式大致相似：位於菌落邊緣的ISL1+細胞環繞着一圈BRA+細胞，而SOX2+細胞位於中心（圖1a）。
然而，在較晚時間點，還觀察到相當數量的BRA+細胞散在分佈於遠離該環狀區域的菌落中心處，在72小時最為明顯（圖1ab，白色箭頭）。與經典標誌物在xy平面中相對靜態的表現不同，垂直的z方向上隨時間發生了顯著的形態變化。72小時時，菌落厚度相對均一，但到96小時時，邊緣相對於菌落中心隆起，且菌落在徑向方向上略有擴張（圖1b，補充圖1a）。此外，在菌落中心，到96小時時，在多層SOX2陽性細胞核下方持續存在一層對ISL1、SOX2和BRA均呈陰性的細胞。
96小時時這種邊緣隆起的多層組織結構在明場圖像中表現為較暗的中心以及邊緣周圍更暗的一圈（補充圖1b）。我們開發了一套定製的圖像分析流程，能夠對3D中的單個細胞核進行準確分割，並獲得其位置和熒光強度資訊（方法，補充圖1c）。單細胞定量顯示，在同一實驗中，菌落形態和標誌物表達具有高度可重複性（圖1c，補充圖1d），儘管邊緣與中心的相對高度以及菌落直徑在不同實驗之間存在一定變化。我們在三種不同的細胞系中證實了這一結果（SI圖1e）。
中央上層中的細胞維持了多能性、上胚層樣身份，因為SOX2陽性細胞共表達NANOG和OCT4（圖1e）。對上皮標誌物EPCAM和ECAD以及間充質標誌物SNAI1、NCAD和VIM的染色顯示，菌落頂部覆蓋着連續的上皮層，其下方為間充質細胞（圖1fg）。在菌落邊緣、條紋樣區域之外，還存在另一群間充質細胞（圖1fg）。上皮頂端表面標誌物PODXL僅出現在菌落表面，這表明中心區域多層多能性細胞核屬於單一的假復層上胚層樣結構，其下方為間充質（圖1g）。
72小時時中心區域BRA+細胞的散在分佈提示，該間充質可能是由細胞從原條（PS）樣環遷出並隨後下調PS標誌物而形成的中胚層。因此，我們對PS標誌物的表達進行了更為細緻的研究，並發現了出乎意料的異質性。儘管BRA、EOMES和MIXL1的染色結果看起來非常相似（補充圖1f,g），但它們的疊加分析和定量結果顯示，在48小時和72小時時存在梯度性表達：BRA在外側表達更高，而EOMES和MIXL1在內側表達更高（圖1h,i）。
這與它們分別在後部和前部原條中的不同作用一致，因為菌落邊緣的BMP信號更高，因此類似於胚胎的後部。
為了確定所觀察到的間充質群體是否確實代表不同的中胚層細胞類型，我們在48、72和96小時分別進行了重複的單細胞RNA測序。我們構建了整合的UMAP可視化圖譜，並使用Leiden算法對數據進行聚類，所選擇的參數使得48小時的聚類結果與此前獲得並在42小時得到驗證的結果一致。
差異表達分析獲得了各群的標誌物，其中一個簇包括TBX6、DLL3、RSPO3、FOXC1，另一個簇包括FOXF1、HAND1、TMEM88。
為了驗證這些細胞的身份，我們隨後將gastruloid的轉錄組映射到CS7期人類原腸胚上。
我們的發現提示，在CS7期人類胚胎中被註釋為晚期中胚層的細胞，也可能是側板中胚層和連接柄中胚層的混合群體。與此一致的是，該樣本包含連接柄和體壁胚外中胚層（Tyser）。
免疫熒光染色證實了由TBX6和FOXF1標記的不同細胞群體的存在，並揭示了清晰的空間組織。TBX6+中胚層在中心區域類上胚層細胞下方形成一層（圖3a-c，補充圖3a）。此外，在48小時時，TBX6+細胞在菌落隆起部分下方形成一個環，位置對應於條帶樣環（圖3a），這與TBX6在原條中期至晚期的表達一致。
隨後，我們進一步確定了中胚層亞群的空間組織。我們發現，位於上胚層下方的中胚層層同時表達FOXC2和TBX6，而外圍的TBX6+環不表達FOXC2，這提示該環可能代表晚期原條或新生中胚層，而從原條遷移到中心的細胞則是已分化的軸旁中胚層（圖3j-l，補充圖3j）。我們還證實，FOXF1+群體的部分亞群表達早期心臟標誌物NKX2.5（圖3m,n，補充圖3k）以及CS標誌物ALCAM（圖3o,p，補充圖3l）；其中，NKX2.5更多位於底部邊緣，ALCAM則更靠內側且更多位於上方，接近ISL1+羊膜。
綜上，這些數據表明，中心區域及菌落邊緣的間充質層代表不同的中胚層群體。
在72小時於原條樣結構之外觀察到原條樣細胞，提示中胚層細胞群起源於該原條樣區域，並從該區域遷移至菌落中心和邊緣。與此一致，活細胞成像顯示，BRA+細胞自約48小時開始從原條樣環向外遷移，儘管遷移起始時間在不同實驗之間存在一定差異（補充影片1）。此外，對BRA陽性細胞的單細胞追蹤顯示，在61小時位於中心的幾乎所有BRA+細胞均起源於36小時的原條樣環（
側板中胚層依賴高BMP信號，而旁軸中胚層依賴Wnt信號
隨後，我們在48小時後抑制Wnt信號。這並不影響FOXF1的表達，但消除了TBX6原條樣環，並顯著減少了中心區域的TBX6+細胞群（圖4i、j，補充圖5f-h）。我們納入ISL1作為參考共染色標記，其與FOXF1部分重疊，結果發現其也不受Wnt抑制的影響。最後，我們研究了Nodal信號，因為一般認為這兩類中胚層細胞群都需要降低的Nodal信號，而原條分化後較高的Nodal信號則會生成內胚層
我們將二維gastruloid的培養時間從2天延長至4天，並表明在此期間，發育以有序且可重複的方式推進，重現了此前模型尚未涉及的、更晚期原腸胚形成階段的部分特徵。我們觀察到，由原條樣區域發生的向內定向遷移，在中心多能性上皮下方形成了一個旁軸中胚層樣層；同時還觀察到向外遷移，在菌落邊緣形成了一個側板和胚外中胚層環。這些過程是自組織的，並且獨立於培養基中用於啟動分化的外源BMP。我們表明，通過操控細胞信號傳導可以改變譜系分配。
通過改變BMP、Wnt和Nodal信號之間的平衡，細胞命運由側向/後部轉向內側/前部。此外，我們的旁軸樣和側板樣中胚層與CS7期人類胚胎中所註釋的新生中胚層和進展中胚層高度相似，從而驗證了這些延長培養的gastruloid可作為一個能夠真實重現胚胎中胚層分化的平台。
由於該系統具有高度可重複性，並且能夠隨時間追蹤細胞，因此它為原腸胚形成機制提供了新的見解。事實上，我們的結果表明，如今被廣泛使用的“nascent（新生）”、“emergent（出現中的）”和“advanced（進展的）”中胚層這些術語
許多重要問題仍有待解答。關於驅動哺乳動物中胚層遷移的機制，目前所知甚少；例如，是否涉及化學吸引物或排斥物，或者中胚層是在何種力學機制下於類上胚層之下移動。譜系特化同樣尚未得到充分理解。例如，儘管FOXF1陽性中胚層依賴於BMP信號傳導，但BMP信號傳導在遠大於FOXF1表達區域的範圍內處於高水平，因此尚不清楚BMP信號傳導是在何時以及如何促使一部分條紋樣細胞分化為側板或胚外中胚層，而非軸旁中胚層。另一個有趣的問題是，系統中不同組織之間的比例由何種因素控制。
例如，儘管多能層變為假復層化，但其並未發生側向擴張或屈曲。
據我們所知，這是唯一一個人類原腸形成模型，在該模型中，不同的中胚層譜系已被證明以時空組織化的方式產生，並通過從條紋樣區域遷移而形成。二維微圖案化方法非常適合研究其潛在機制，因為遷移發生於易於操控的微圖案化基底上，例如可以改變其剛度或嵌入微珠以進行牽引力顯微測量。
然而，技術優勢與簡潔性是有代價的：二維原腸胚樣體缺乏許多方面的
該系統的簡潔性及其由此產生的生物學侷限性，不僅在於技術層面使某些問題更易於處理：在遵循研究指南和政策方面也具有顯著優勢。作為一種非整合型、基於幹細胞的胚胎模型（SCBEM），其不含滋養層或下胚層，也不打破旋轉對稱性，因此這些結構的發育潛能非常有限。這在一定程度上緩解了，甚至消除了與整合型模型相關的潛在倫理顧慮，並且符合美國聯邦資助政策。
本研究產生的原始單細胞RNA測序數據已存入GEO（GSE262081），分析後的數據將在發表時補充。原始圖像數據可按要求提供。
所有用於數據分析和模型模擬的代碼可在以下位置獲得
所使用的細胞系包括胚胎幹細胞系ESI017（XX）、誘導多能幹細胞系PGP1（XY），以及經遺傳修飾的胚胎幹細胞系H9（XX）T（brachyury）-neon。
人胚胎幹細胞或誘導多能幹細胞在商業化界定的多能性維持培養基mTeSR1（StemCell Technologies）中培養，並接種於包被有Cultrex（R&D Systems）的組織培養板上。常規細胞維持過程中，每3天進行一次傳代。對於整克隆傳代，L7
為了通過微圖案化誘導細胞形成二維原腸胚樣體，我們遵循了 Teague 等人（2024）的方法，並在 BMP 處理前增加了微圖案上的生長期以及每日換液步驟。簡而言之，將細胞重懸為單細胞懸液，並接種到經層粘連蛋白包被的微圖案孔中，培養基為含 ROCK 抑制劑（RI）（MeChemExpress，貨號：HY-10583）的 mTeSR。初次接種 30 分鐘後，用 PBS−/− 清洗微圖案孔，以洗去未貼壁細胞。
隨後，細胞在加入 BMP4 處理前，先於 mTeSR 中預培養 24 小時，BMP4 處理通過完全更換培養基實施。對於所有微圖案化分化實驗，每 24 小時進行一次含指定處理條件的完全換液。實驗在微圖案化 18 孔 Ibidi 載玻片（貨號：81818）中進行，載玻片按前述方法制備。
18 孔 Ibidi 載玻片中的樣品先以 PBS−/− 漂洗，隨後在室溫（RT）下用 4% 多聚甲醛固定 30 分鐘，之後再用 PBS−/− 清洗兩次。然後，樣品在 PBS−/− 中用 0.1% Triton X-100 通透 10 分鐘，並使用封閉液（PBS−/− 中含 3% 驢血清 + 0.1% Triton X-100）進行封閉。封閉後，樣品於 4°C 下在封閉液中加入指定稀釋度的一抗孵育過夜。
次日，樣品用 PBST（PBS−/− 中含 0.1% Tween 20）清洗 3 次，隨後在避光條件下於室溫用含 DAPI 的二抗溶液（1 μg/ml；ThermoFisher Scientific）孵育 30 分鐘。抗體及其稀釋倍數列於補充表 2 和 3。染色完成後，樣品再用 PBST 清洗 2 次，並加蓋保存在含 0.01% 疊氮化鈉的 PBS−/− 中。
固定樣品成像使用 Nikon/Yokogawa 旋轉盤共聚焦顯微鏡，配備 ×40 硅油物鏡，並使用 NIS Elements AR 軟件 5.41.02 版本。為提高透明度，樣品在成像前按照 Zhu 等人（2019）的方法使用光學透明化緩衝液（FOCM）處理。50% FOCM 緩衝液通過在 PBS−/− 中稀釋配製，並在成像前立即加入。活細胞成像使用 Andor Dragonfly/Leica DMI8 旋轉盤共聚焦顯微鏡，配備 ×20 空氣物鏡，並在受控溫度（37°C）、CO
我們採用先前描述的流程，基於細胞核熒光（固定細胞中的 DAPI 染色，活細胞中的 H2B::RFP）對各個 z 層切片中的細胞核進行了分割。
用於單細胞RNA測序的樣本依據製造商說明書，採用10x Flex固定試劑盒進行採集。單細胞RNA測序由密歇根大學先進基因組學核心平台完成。固定後的解離細胞使用Luna Fx7（Logos Biosystems）進行計數。按照10X Genomics Chromium Fixed RNA Profiling Reagent Kits for Multiplexed Samples（PN 1000568）的製造商說明進行探針雜交、樣本混合及後續處理。
最終文庫質量使用LabChip GXII HT（PerkinElmer）進行評估，文庫濃度使用Qubit（ThermoFisher）進行定量。混合文庫按照製造商方案進行雙端測序（Illumina NovaSeq X Plus）。採用BCL Convert Software（Illumina）生成去複用的FASTQ文件，並使用CellRanger 7.0.1（10X Genomics）在預設參數下，基於10x提供的人類參考基因組GRCh38進行序列比對並生成計數矩陣。
用於與CS7期人類原腸胚進行比較
進一步分析在Python環境中使用Scanpy完成
細胞核基於T-neon（brachyury）通道的最大強度投影，採用定製的CellPose模型進行分割
所有實驗均至少重複兩次。所有重複實驗的嘗試均獲得一致結果。除非另有特別說明，所有定量分析均在相同實驗條件下的4個菌落中進行（n=4）。
我們的研究遵守所有倫理規範。我們已獲得密歇根大學人類多能幹細胞研究監督委員會（HPSCRO）的批准，開展人胚胎幹細胞和人誘導多能幹細胞相關研究。
感謝Aryeh Warmflash和Adam Helms就稿件提出的討論與反饋，並感謝Susana Chuva de Sousa Lopes指出Tyser等人的註釋中未包含連接柄。文庫製備和下一代測序由密歇根大學先進基因組學核心平台完成。本研究得到NSF RECODE（2033654）、美國國家普通醫學科學研究所（NIGMS R35GM138346）以及Branco Weiss Fellowship – Society in Science的資助。
EF部分得到NIH Cellular Biotechnology Training Program（T32GM145304）的支援，KJ部分得到Michigan Pioneer Postdoctoral Fellowship和NIH F32 Ruth L. Kirschstein博士後國家研究服務獎（5F32HD108980-02）的支援。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.21.585753
🏷️ 二維原腸胚樣體 人多能幹細胞 中胚層發育 原腸胚形成 單細胞轉錄組