人類著床前胚胎中頻繁獲得基因組異常是妊娠丟失的主要原因，但這並不必然阻止健康後代的出生。然而，基因組異常對人類早期胚胎細胞狀態及發育的影響在很大程度上仍不清楚。在此，我們對人類著床前胚胎中的非整倍體進行表徵並重建基因調控網絡，且利用單細胞基因組與轉錄組聯合測序（G&T-seq）研究由非整倍體引發的基因表達與發育擾動。在基因組層面，我們表明，獲得性的染色體數目和結構異常在早期胚胎發生的所有階段以及所有細胞譜系中均普遍存在。
在轉錄組層面，我們鑑定出細胞身份的調控因子，並揭示了由10個主要基因調控模組構成、包含248個轉錄因子的網絡，該網絡刻畫了人類著床前胚胎的不同譜系。通過整合單細胞DNA與RNA資訊，我們揭示了在人類著床前發育過程中，胚胎細胞中相應基因的缺失或增加如何影響其表達水平，以及拷貝數異常的轉錄因子基因如何擾動整倍體區域中其對應靶基因的表達。
此外，我們發現大多數非整倍體細胞表現出發育延遲和適應性下降，這提示嵌合性二倍體-非整倍體胚胎內部存在細胞競爭，該過程可能有助於選擇性清除非整倍體細胞，並促使嵌合性二倍體-非整倍體胚胎產生健康後代。總之，我們的多模態分析為人類早期胚胎發育提供了前所未有的見解。
著床前胚胎發生包括生命最初的幾輪細胞週期，這是一個重要的7天時期，在此期間，具有全能性的受精卵產生最初分化的細胞類型，以實現子宮著床和個體發育。理解這一階段對於辨明不孕、著床失敗和自然流產的原因，以及發育障礙，至關重要。儘管這似乎有悖直覺，人類著床前胚胎卻極易發生染色體不穩定性（CIN），不僅在……之後如此
獲得性的染色體和/或片段性非整倍體——以下統稱為（片段性）非整倍體——不僅可導致著床失敗和自然流產
來自哺乳動物細胞系和酵母的研究
近年來，低輸入和單細胞技術的進步為研究常呈嵌合狀態的人類胚胎中的基因表達變化提供了機會，這類胚胎由（片段性）非整倍體細胞和整倍體細胞共同組成。一項研究通過將胚胎細胞分配用於基因組分析，或將其他細胞用於基因表達分析，對發育至桑椹胚階段的人類胚胎進行了研究，並報道了在4細胞至8細胞階段胚胎基因組啟用（EGA）之前，含有非整倍體的胚胎的基因表達特徵。
在此，我們對人類植入前胚胎的同一單個細胞應用基因組與轉錄組聯合測序（G&T-seq），以研究早期胚胎發生過程中（片段性）非整倍體的細胞生物學。我們發現，常染色體DNA的增加與缺失會導致基因劑量效應。
為在植入前發育過程中以單細胞分辨率研究整個胚胎的DNA和RNA，我們採用單細胞G&T測序（scG&T-seq）分析了來自112個人類胚胎的756個單細胞，這些胚胎涵蓋了受精後第一週。
利用DNA拷貝數分析，我們將基因組分為四類：1）正常；2）非整倍體（即一條或多條染色體發生缺失或增加，並可伴有額外的片段性異常）；3）片段性非整倍體（即僅染色體片段發生缺失或增加）；4）混亂型（包括超過一半常染色體存在片段性拷貝數異常）（方法，
隨後，我們研究了來源於scG&T的576個細胞的轉錄組（
我們預期非整倍體細胞中的基因表達會受到強烈擾動。然而，二倍體細胞與非整倍體細胞在聚類後並未彼此分離（
為進一步審視（片段性）非整倍體在人類胚胎中的潛在功能影響，我們首先重建了人類植入前發育的基因調控網絡。基因調控網絡（GRN）決定細胞身份及命運轉變。我們使用pySCENIC，這是一種結合基因與轉錄因子（TF）共表達以及順式調控基序分析、以推斷每個細胞中GRN活性的方法。
為預測哪些TF可能驅動人類植入前胚胎發生中的細胞身份，我們為每個譜系中的每個調控子分配了特異性評分，並按照特異性由高到低對調控子進行排序。
儘管大多數基因組異常細胞的轉錄組在聚類後與二倍體細胞一致（
隨後觀察到的DGDE促使我們對基於scRNA-seq數據推斷胚胎中（片段性）非整倍體的方法進行優化和基準評估，並以同一單個細胞的DNA測序結果作為真實標準（
總之，儘管（片段性）非整倍體會導致直接基因劑量效應，但其幅度取決於非整倍體的性質（增加的效應高於缺失）以及胚胎的發育階段（在E3和E5-6期強於其他階段）。這些DGDE使CNV推斷成為可能，且在胚胎基因組啟用後（post-EGA）表現最佳，並且這種效應因基因而異。
當TF基因發生缺失或重複時，反過來可能影響其二倍體靶基因的表達，這一過程我們稱為TF基因的“間接基因劑量效應”（IGDE），並會擾亂基因調控網絡。我們開發了一種用於單細胞IGDE分析的方法（
鑑於非整倍體可能導致直接和間接的基因劑量效應，我們進一步研究了其對譜系決定和發育進程的影響。首先，我們考察了胚胎細胞的物理年齡——即自受精以來的胚胎發育天數——相對於其在轉錄軌跡上的分子偽時間年齡。重要的是，這表明二倍體細胞，尤其是在 E3、E4、E5 和 E7 階段，往往在發育進程上更為超前，而非整倍體細胞通常在偽時間上表現出滯後（
總之，我們表明，獲得性（節段性）非整倍體會導致胚胎內細胞在分子定義的發育年齡上呈現異質性，其中細胞間基因組異常的差異通常與發育延遲相關，而在少數情況下則與發育加速相關。
為了將直接和間接的基因劑量效應與非整倍體細胞中觀察到的發育延遲相統一，我們接下來通過比較著床前胚胎基因組啟用前（pre-EGA）、胚胎基因組啟用後（post-EGA）、內細胞團（ICM）和滋養外胚層（TE）中二倍體與非整倍體細胞之間的差異基因表達、差異調控子活性以及差異基因集表達分析（分別簡稱為 DGE、DRE 和 DGSE），研究細胞對（節段性）非整倍體的響應（
與其發育延遲表型一致，基因表達特徵表明，在胚胎基因組啟用之後的所有細胞譜系中，非整倍體細胞的適存性均較低（
未摺疊蛋白反應（UPR）是由內質網（ER）中未摺疊或錯誤摺疊蛋白增加所觸發的，代表細胞為恢復內質網穩態而啟動的一種生存應答。
最後，在非整倍體滋養外胚層細胞中檢測到了提示促增殖和抗增殖細胞表型同時存在的基因表達特徵（
重要的是，我們的基因表達分析表明，人類著床前胚胎中的非整倍體細胞自 EGA 之後即逐漸形成一種適存性較差的細胞表型，這進一步佐證了其在轉錄組偽時間上的發育延遲。
在單細胞水平研究人類著床前胚胎基因表達的工作，通常僅基於轉錄組分析，並且經常忽視其對染色體不穩定性的極高易感性。
整合 DNA 和 RNA 測序分析表明，直接基因劑量效應在人類胚胎細胞中於 EGA 時啟動，其效應大小隨後取決於發育階段。令人驚訝的是，這些直接基因劑量表達效應（DGDE）通常比依據受影響基因的 DNA 拷貝數所預期的程度更為溫和。在一種模型中，新近獲得的 DNA 缺失區域內基因的 DGDE 大小會被低估，因為這些基因的轉錄本可從二倍體前體細胞中遺傳而來。然而，在另一種模型中，劑量補償也可能導致 DNA 缺失所產生的 DGDE 較為溫和。
在基因表達調控中，轉錄因子（TF）通常編碼於與其靶基因不同的染色體上。
接下來，我們研究了由非整倍體誘導的直接和間接基因表達劑量效應如何影響胚胎中非整倍體細胞的發育進程。首先，我們比較了細胞受精後的年齡與其在轉錄組軌跡上的擬時年齡。值得注意的是，與整倍體細胞相比，非整倍體細胞在發育過程中往往出現滯後，這提示隨着基因組異常的獲得，細胞適應性下降。這一點確實得到了基因表達特徵的支援：EGA之後，非整倍體細胞中與（線粒體）核糖體生物發生、翻譯、能量穩態及增殖受損相關的信號明顯存在。
該基因表達特徵還得到了其他研究的進一步佐證，這些研究利用單細胞單模態RNA測序，考察了主要處於囊胚期的人類胚胎中非整倍體的後果。
隨後，我們探究了何種分子機制可能觸發細胞競爭的發生。近期研究表明，核糖體蛋白（Rp）基因可作為（節段性）非整倍體的感受器。
細胞競爭的其他起始因素也已被鑑定。例如，線粒體功能障礙會在小鼠上胚層細胞中觸發細胞競爭。
總之，我們的多模態分析揭示了人類發育第一週的新見解。我們提供了一個獨特而全面的資源，涵蓋驅動著床前胚胎發育的轉錄因子及基因調控網絡，以及這些過程如何受到染色體不穩定性（CIN）的擾動，並進一步可能如何導致嵌合型人類胚胎內部發生細胞競爭。
用於研究的冷凍保存胚胎取自在魯汶大學生殖中心（LUFC）接受體外受精（IVF）並伴有或不伴有植入前遺傳學檢測（PGT）的夫婦所捐贈的胚胎。本研究所用胚胎在合子期（E1——具有2個原核和2個極體）或卵裂期（E3——若具有足夠的形態學質量）進行冷凍保存。
冷凍保存胚胎按照Vit Kit®-Thaw（Irvine Scientific）生產商說明進行復蘇。復甦後，每枚胚胎在Universal GPS®培養皿（LifeGlobal）的一個孔中培養5小時至48小時，孔內含40µl GM501培養基（Gynemed），覆蓋礦物油（Gynemed），培養條件為37°C、6% CO2、pH 7.25–7.35，並置於時差培養箱（ASTEC Penguin incubator）中。
合子培養用於獲得E1、E2和E3胚胎；卵裂期胚胎培養用於獲得E3、E4和E5胚胎；囊胚培養用於獲得E5、E6和E7胚胎。由於手工單細胞解離的操作要求，胚胎的復甦和培養安排為同一天最多解離8枚E1-2胚胎、4枚E3-4胚胎和1枚E5-7胚胎。
進行解離時，每枚胚胎從培養基中取出，置於40µl預溫的Ca中。
單細胞按照G&T-seq方案進行處理。
通過局部讀段深度分析估計DNA拷貝數變異，具體方法如前所述。
經G&T-seq處理細胞的RNA-seq文庫獲得了中位數為1.47M的唯一比對讀段，平均每個細胞檢測到10354個基因。
為確定時序性表達基因，我們將廣義加性模型（general additive model，GAM；gam 1.16.1）應用於標準化計數數據。在此，細胞根據兩條 slingshot 偽時間軌跡被劃分為兩個集合（以兩條線可視化於
為進行細胞類型判定，首先基於 regulon AUC 矩陣並使用 clustree（0.4.0）對細胞進行聚類。在此，我們依據已知標誌基因的表達來識別各簇可能歸屬的譜系（Epiblast 對應 NANOG，primitive endoderm 對應 SOX17，trophectoderm 對應 GATA3，等等）。隨後，我們在所選簇之間進行了差異基因表達分析（Seurat 3.0.2），並篩選出在各簇中高度上調的基因以及在各簇中不存在的基因，以構建註釋文件。
將該註釋文件與原始計數矩陣一併輸入自動細胞類型分類程序 Garnett（0.1.4），以執行細胞類型分類（
為比較正常與異常拷貝數的基因表達分佈，以每個偽時間分箱中整倍體細胞的基因表達中位數為參照，對標準化基因表達中位數進行了中心化處理（
我們使用 Velocyto Python 軟件包（v0.17.17）生成內含子和外顯子讀取計數，並將內含子讀取比例定義為每個細胞中內含子計數佔總計數的比值。
我們使用多組學 G&T 數據對 inferCNV 推斷得到的拷貝數判定結果進行了基準評估。我們直接利用 scG&T 數據中基於 DNA 的拷貝數判定作為真實值來評估該方法。我們將以鹼基為單位的真陽性率和真陰性率分別定義為：基於 DNA 測序判定為非整倍體或二倍體的片段中，被基於 scRNA 的 InferCNV 判定結果正確重現的比例（
當染色體臂中拷貝數狀態 ≠ 2 的區域所佔比例超過 60% 時，便將該染色體臂（不包括近端着絲粒染色體 13–15 和 21–22 的短臂）歸類為異常。該閾值通過在 G&T 數據上進行優化得到，方法是如上所述計算真陽性、真陰性、假陽性和假陰性率，但在染色體臂水平上進行。我們還計算了精確率、召回率和 F1 分數，結果表明將染色體臂中 60% 的區域作為異常判定閾值是最優的。
在該閾值下，我們觀察到 EGA 後 DNA 與 RNA 基於染色體臂水平拷貝數判定結果之間達到最佳一致性，且細胞分類的精確率和召回率分別為 0.71 和 0.77（
為計算轉錄因子非整倍體拷貝數狀態對下游二倍體靶基因的劑量效應，我們首先按照“Regulon Analysis”一節所述的方法，確定了每個轉錄因子調控子中的下游靶基因。對於每個擬時序分位數，我們檢驗了在該擬時序分位數內，攜帶轉錄因子擴增或缺失的細胞與同一擬時序分位數內二倍體細胞相比，其靶基因經中位數中心化後的表達分佈是否存在差異（如“Direct gene dosage effect analysis”所述）。
我們僅對那些在該分位數內觀察到至少10個細胞攜帶相應轉錄因子擴增或缺失的轉錄因子進行檢驗。為檢驗總體間接基因劑量敏感性，我們使用 Fisher’s Omnibus 檢驗合併擴增和缺失的 p 值，並採用 Benjamini-Hochberg 方法校正多重比較導致的假發現率膨脹。
二倍體與非整倍體細胞之間的差異表達基因按擬時序分位數和註釋譜系分別確定。相關分析使用 Seurat 中的 FindMarkers 函數，採用“MAST”方法，logfc 閾值設為 0.05，min.pct 閾值設為 0.5。在註釋譜系中進行差異表達基因檢驗時，擬時序作為模型中的潛變量納入。多重檢驗校正通過 R 中的 p.adjust 函數，採用 Benjamini-Hochberg 方法對 p 值進行調整。
對於 −log10(pvalue) < 5.7 的基因繪製基因標籤，該閾值對應於全基因組範圍顯著性的 Bonferroni 閾值，其中顯著性水平設為 0.05，多重比較次數設為所檢驗基因數的 4 倍。對於差異基因集分析，基因集通過人工整理獲得，或來源於使用 msigdbr R 包（版本 7.2.1）的 KEGG Pathway 註釋。調控子基因集使用上述方法通過 PySCENIC 獲得。每個細胞中每個基因集的 AUC 值使用 AUCell R 包（版本 1.8.0）計算。
非整倍體與二倍體細胞之間的差異基因集表達按擬時序分位數和註釋譜系分別通過對 AUC 值進行 Wilcoxon 秩和檢驗來確定。隨後採用 Benjamini-Hochberg FDR 校正對多重比較的 p 值進行調整。
為確定並分類相關的失調功能，我們在胚胎發育、非整倍體、應激反應、增殖和凋亡的背景下，對每個基因進行了基因本體分析（GO）以及人工文獻整理。
本研究已獲得魯汶大學醫院/魯汶大學倫理委員會（S58250，S65358）以及比利時胚胎研究聯邦委員會（ADV_62，ADV_089）的批准。
T.V. 和 V.P. 構思了本研究。E.F.G. 在 A.K. 的協助下開展了胚胎實驗。A.S.、J.C. 和 J.D. 在 J.C.H.、R.V.、M.V.d.H. 和 S.V. 的協助下進行了計算分析；J.V.H.、I.C.M. 和 T.V. 開發並建立了自動化 G&T-seq 及基礎分析框架。S.D. 和 K.P. 協調並監督了捐贈用於研究的胚胎的復溫。K.V. 協助了研究管理工作。
E.F.G.、A.S.、J.C.、J.D.、V.P.、J.C.H.、R.V.、J.R.V. 和 T.V. 對數據進行了解釋。E.F.G.、A.S.、J.C.、J.D.、V.P. 和 T.V. 撰寫了手稿。所有作者均閱讀並批准了手稿。
T.V. 和 J.R.V. 是已授權專利 WO/2011/157846（單細胞單倍型分型方法）、WO/2014/053664（通過對少量遺傳物質進行測序實現高通量基因分型）以及 WO/2015/028576（利用多態變異等位基因頻率進行單倍型分型和拷貝數分型）的共同發明人。
E.F.G. 是佛蘭德研究基金會（FWO）的博士研究員。J.D. 是 FWO 的博士後研究員。
T.V. 實驗室與本研究相關的工作得到了佛蘭德研究基金會（FWO；G081318N；G0C6120N；G088621N）、魯汶大學（KU Leuven；SymBioSys - C14/18/092；C14/22/125；IDN/19/039）、基礎設施資助（Hercules 基金會 1 類資助——AKUL/13/41；抗癌基金會項目 2015-143；以及 FWO I001818N）以及歐盟“地平線 2020”研究與創新計劃（資助協議編號 824110——EASI-Genomics）的支援。
Pasque 實驗室的研究得到了佛蘭德研究基金會（FWO）（授予 V.P. 的 Odysseus Return Grant G0F7716N；授予 V.P. 的 FWO 項目 G0C9320N 和 G0B4420N）以及魯汶大學研究基金（授予 V.P. 的 BOFZAP 啟動基金 StG/15/021BF、C1 項目 C14/16/077 及項目經費）的支援。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.03.08.530586
🏷️ 著床前胚胎 非整倍體 染色體不穩定性 單細胞多組學 基因調控網絡 細胞競爭