胚胎類器官正作為研究早期哺乳動物發育的強大模型而不斷湧現。例如，來源於幹細胞的“原腸胚樣體”可形成包含全部三個胚層的延長結構。
早期人類發育的分子與細胞生物學具有基礎性的重要意義。然而，由於倫理、技術和實踐上的困難，研究的機會
研究早期人類發育的另一種方法涉及
我們考察了採用已發表方案生成的小鼠與人類原腸胚樣體之間的差異，這使我們提出如下假設：與小鼠原腸胚樣體以及相比，先前報道的人類原腸胚樣體中的神經中胚層祖細胞（NMPs）更傾向於體節而非神經命運。
我們着手誘導具有較已發表方案更先進形態學特徵的人類原腸胚樣體。
我們試圖追蹤在人類原腸胚樣體形成這一時間進程中關鍵細胞群體的出現（
對48至96小時人類原腸胚樣體與CS7期人類胚胎譜系進行整合投影的資訊量較低，可能是因為這些原腸胚樣體已進展超出了這一階段。
接下來，我們試圖探索人類與小鼠原腸胚樣體之間的差異。在胚胎中，後部神經管來源於稱為神經中胚層祖細胞（NMPs）的雙潛能幹細胞。
為促進NMPs向神經譜系分化，我們試圖提供額外的信號線索，這些線索在人類原腸胚樣體系統中推測供給不足。視黃酸（RA）即為這樣一種信號分子，能夠誘導NMPs產生神經細胞命運，兩者中均是如此。
我們推測，持續暴露於RA可能會擾亂其他細胞類型的分化，
這些RUES2-GLR中胚層特異性標誌物的空間分佈
為鑑定存在的細胞類型，我們將單細胞RNA測序（sc-RNA-seq）應用於人類RA-原腸胚樣體。對5,347個和18,324個單細胞表達譜進行聚類與註釋，分別在96小時和120小時鑑定出9種和12種細胞類型（
我們驚訝地觀察到其中許多額外的細胞類型，
為更深入研究神經外胚層潛在的空間模式化，我們對神經管、神經嵴和神經祖細胞進行了單獨重分析，隨後考察了所得嵌入空間中標誌基因的表達模式（
在人類RA-原腸胚樣體中，神經發生的任何方面是否仍在進行？神經祖細胞來源於神經管中由放射狀膠質細胞構成的幹細胞庫。我們分析了HES基因的表達模式，它們是放射狀膠質細胞的標誌物。
我們還試圖通過對旁軸中胚層衍生物進行重分析，對體節開展更為詳細的分析（
總體而言，這些分析和免疫染色實驗證實，通過引入視黃酸的不連續處理方案，我們能夠在人類 gastruloid 中誘導形成神經管和分節的類體節結構。儘管由於缺乏相當於脊索、可分泌 SHH 的結構，背腹軸尚未完全建立，但人類 RA-gastruloid 中包含的若干細胞亞群，比此前在人或小鼠 gastruloid 模型中所實現的細胞類型更為成熟，這提示沿背腹軸（神經嵴）和內外側軸（中間中胚層）均存在功能性的信號梯度。
特別是在 120 小時的 gastruloid 中，我們還觀察到其向更高分化細胞類型進一步進展的趨勢（
人類 gastruloid 的最初報道基於形態學特徵和 Tomo-seq 進行了評估
然而，這些以及其他分期方法在一定程度上都
作為第一步，我們對人類 gastruloid 和 RA-gastruloid（96–120 小時）的 pooled 樣本的 pseudobulk RNA-seq 表達譜，以及兩個可獲得的人類胚胎 CS7 階段數據集，進行了主成分分析（PCA）
沿 PC2 方向，人類 gastruloid 能夠按照時間正確排序（
隨後，我們進一步尋求實現更精細的分期，並將人類 gastruloid 的成熟過程與
儘管存在物種差異，這些經分期的小鼠胚胎沿人類定義的 PC2 也表現出良好的有序排列，這與該主成分捕捉到了哺乳動物發育進程某種普遍特徵的觀點一致（
鑑於 gastruloid 僅模擬了……的某些方面
總體而言，這些結果表明，人類 RA-gastruloid 可成熟至比先前報道的哺乳動物 gastruloid 模型更高級的階段，大致接近於小鼠 E9.5–E10.5 的對應水平。然而，這種更大的發育推進可能伴隨着與……的不同步
接下來，我們試圖評估人類 RA-gastruloid 作為一種可篩選體系的潛力，即在其分化過程中通過化學擾動經典發育信號通路。已知 WNT 信號傳導對體節形成具有關鍵作用
BMP 信號傳導在早期發育過程中對譜系分離與維持發揮多種重要作用。為擾動人類 RA-gastruloid 中的 BMP 信號傳導，我們修改了實驗方案，在 48 小時後向體系中加入 LDN193189（以下稱 LDN；一種 BMP 抑制劑）或 BMP4（
為考察經 LDN 處理的 RA-gastruloid 的發育進程，我們將其映射到
然而，儘管神經細胞顯著擴增，LDN 處理的 gastruloid 中神經嵴細胞也明顯減少（
隨後，我們進一步探究人類 RA-gastruloid 作為遺傳擾動可篩選模型的潛力。為此，我們選擇了轉錄因子 PAX3 和 TBX6，因為相應突變體在小鼠模型中表現出早期致死性
在小鼠中，Tbx6 是體節譜系分化中公認的主調控因子，並通過抑制 a 的表達來抑制神經元譜系。
總體而言，我們得出結論：RA-胃胚樣體可作為一種多功能且穩健的模型，用於研究在人類著床後發育過程中，細胞類型如何在化學與遺傳擾動作用下出現的細胞與分子機制。
合成哺乳動物胚胎學領域正處於一個顯著發展的軌道上。對於人和小鼠而言，“幹細胞胚胎”模型使得早期發育能夠接受詳細的觀察性與擾動性研究，而這在其他情況下根本無法實現。
目前仍不清楚，為什麼間斷性的 RA 處理方案會在人類胃胚樣體中導致神經管和分節體節的形成，而在小鼠胃胚樣體中，僅 Matrigel 就足以實現這一過程。
幹細胞胚胎模型的大量湧現正在揭示一些新的挑戰。例如，難以將這些模型在時間上校準至對應的發育階段。
日益複雜的幹細胞胚胎模型也可能引發倫理方面的擔憂，而這些擔憂或可通過計算分期加以緩解。例如，在腦類器官的研究背景下，人們已對神經活動提出了相關擔憂。
在人類 RA-胃胚樣體中，類胚胎形態結構形成的效率遠高於相關小鼠系統中的報道（人類 RA-胃胚樣體中為 89%［同時具有神經管和分節體節］，而小鼠 TLS 中為 50%）。
多能幹細胞系 hESCs（RUES2-GLR）由 Ali Brivanlou 博士（洛克菲勒大學）饋贈。人 ES 細胞在 Geltrex（Thermo，A1413201）包被的培養板上，使用 StemFlex 培養基（Thermo，A3349401）維持培養，並按照製造商建議，常規使用 StemPro Accutase（Thermo，A1110501）傳代至新的 Geltrex 包被孔中。
在傳代後的最初 24 小時內，hESCs 在含 10 μM Y-27632（Sellek，S1049）的 StemFlex 培養基中培養，以防止細胞凋亡。
RNP 複合物按照製造商提供的流程製備。簡而言之，等摩爾量的 crRNA 和 tracrRNA（IDT，1072532，列於
對於整體免疫染色，胃胚樣體在 4 °C 下於 4% 多聚甲醛中固定過夜，隨後用 PBST（0.2% Tween20）清洗，在封閉液［PBS，含 0.1% BSA 和 0.3% Triton X-100］中於 4 °C 浸泡過夜，隨後在 4 °C 下與用封閉液稀釋的一抗孵育過夜。樣品隨後用清洗液［PBS，含 0.3% Triton X-100］清洗，在 4 °C 下與二抗和 DAPI 孵育過夜，然後清洗並使用 Fluoro-KEEPER 抗淬滅封片劑（Nacalai USA）封片。
對於鬼筆環肽染色，將 Alexa Fluor™ 647 Phalloidin（A22287；Thermo）以 1:400 的稀釋比例加入二抗中。所有樣品均使用 LSM710（Zeiss）或 LEICA SP8X（Leica）共聚焦顯微鏡進行分析，並設置未加入一抗的陰性對照樣品。本研究中使用的抗體列於
使用微量移液器從96個孔中收集胃胚樣體（n = 48–96），轉移至PBS（-）中以洗去培養基，並在37°C下用0.05% Trypsin-EDTA孵育8 min。加入1/10體積的FBS終止反應後，通過反覆吹打將胃胚樣體解離為單細胞。按照製造商說明，將解離後的單細胞懸液加載至Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit（Chromium，PN-1000120），並在10X Chromium controller上運行。
使用Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1（Chromium，PN-1000121）和Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns（Chromium，PN-1000215）構建單細胞RNA-seq文庫。文庫濃度通過Qubit（Invitrogen）測定，文庫通過Tapestation（Agilent）進行可視化。
所有文庫均在NextSeq 2000（Illumina）上進行測序（Read 1：28個循環，Read 2：85個循環，Index 1：10個循環，Index 2：10個循環）。
使用cellranger v6.0.0將鹼基識別結果轉換為fastq格式。
隨後，將cellranger生成的過濾後feature-barcode矩陣導入R中，並使用Seurat v4.1.1轉換為Seurat對象。
採用Seurat中實現的Harmony對時間序列sc-RNA-seq數據集進行整合。簡而言之，將各時間點的數據集合並。對合並後的數據集進行log標準化，並篩選前2,000個高變基因用於後續整合。隨後，對合並後的數據集進行縮放，並回歸掉與細胞週期階段及線粒體污染相關的異質性。採用PCA進行降維，以生成合並數據集中細胞的低維嵌入表示。隨後將該低維嵌入輸入Harmony，以校正不同實驗中採集樣本之間的批次效應。
為了比較胃胚樣體細胞類型與Mouse Organogenesis Cell Atlas（MOCA）中的胚胎細胞類型，以及近期通過sci-RNA-seq3從E8.5獲得的數據，
來自CS12–16期人胚胎的10x Genomics sc-RNA-seq數據
在可能的情況下，所有胚胎數據集均按胚胎進行偽批量化。具體而言，對於每個基因，將與特定胚胎樣本相關聯的所有UMI計數（若為混合樣本，則為特定胚胎樣本）相加。人和小鼠胃胚樣體則按樣本進行偽批量化（因為這些樣本來源於多個胚胎）。具體而言，對於每個基因，將與特定胃胚樣體樣本相關聯的所有UMI計數相加。
由於我們主要關注人類早期胚胎發育，因此採用來自人胚胎發育數據集的高變基因。
採用人胚胎CS12–13期、人胃胚樣體（0–96 hrs）和人RA-胃胚樣體（96–120 hrs）的偽批量表達譜，基於這455個基因構建PCA空間。具體而言，使用Seurat V4.1對偽批量矩陣進行標準化和縮放。
每個胚胎細胞類型中每個基因的表達值，是通過對E8.5至E10.5各時間點所有胚胎中該類型全部細胞的對數轉換後標準化UMI計數求和計算得到的。為儘量減小批次效應，僅選取採用sci-RNA-seq製備的小鼠胚胎。
為將gastruloids中的細胞類型與小鼠胚胎（E8.5–E10.5）中的選定細胞類型進行比較，在兩個數據集中選取同源基因，並採用非負最小二乘迴歸，根據數據集B中所有細胞類型（Mb）的基因表達來預測數據集A中目標細胞類型（Ta）的基因表達，即 Ta = β0a + β1aMb；該分析基於目標細胞類型中表達量最高的200個基因與特異性最高的200個基因的並集。
隨後交換數據集A與B進行預測；即根據數據集A中所有細胞類型（Ma）的基因表達來預測數據集B中目標細胞類型（Tb）的基因表達，即 Tb = β0b + β1bMa。最後，對於數據集A中的每種細胞類型a與數據集B中的每種細胞類型b，將兩個相關係數按 β = 2(βab + 0.001)(βba + 0.001) 合併，以獲得一個統計量，其高值反映雙向且特異性的預測能力。隨後，對E8.5–E10.5所有選定細胞類型的β評分進行標準化。
通過識別標準化β評分大於5且呈1對1對應關係的胚胎細胞類型，或對標準化評分最高的兩種細胞類型之間的發育時間取平均值，來確定gastruloids中每種細胞類型所對應的階段。
我們的研究經過華盛頓大學胚胎幹細胞研究監督委員會（Embryonic Stem Cell Research Oversight, ESCRO）審查並獲得批准。
N.H.和J.S.設計了研究。W.Y.、C.K.和N.H.進行了實驗。W.Y.和N.H.進行了計算分析。C.K.、C.Q.、S.S.協助進行了數據分析。B.K.M.、R.K.G.、S.G.R.、C.L.、R.M.D.和S.S.協助解釋結果。E.N.協助進行了gastruloids成像。J.S.、W.Y.和N.H.撰寫了論文，所有作者均提供了意見。
作者聲明不存在競爭性經濟利益。
在誘導後48小時加入10% Matrigel。
圖示為基於sc-RNA-seq譜的UMAP及無監督聚類結果，並同時展示了用於將這些簇註釋為原條樣細胞、初生中胚層和新生中胚層連續譜系，以及脊索樣細胞和確定性內胚層的標誌基因表達。DE，確定性內胚層；PS，原條。
圖示為基於sc-RNA-seq譜的UMAP及無監督聚類結果，並同時展示了用於將這些簇註釋為神經中胚層祖細胞、體節前中胚層、分化前沿和體節連續譜系的標誌基因表達；此外還包括晚期中胚層、心臟中胚層，以及脊索樣細胞和腸道/內胚層樣細胞。NMP，神經中胚層祖細胞；PSM，體節前中胚層。
展示了結合無監督聚類的 sc-RNA-seq 譜的 UMAP，以及用於將這些簇註釋為神經中胚層祖細胞、體節前中胚層、分化前沿和體節連續譜系的標誌基因表達；此外，還包括高級中胚層和心臟中胚層，以及脊索樣細胞和腸道/內胚層樣細胞。NMP，神經中胚層祖細胞；PSM，體節前中胚層。
展示了結合無監督聚類的 sc-RNA-seq 譜的 UMAP，以及用於將這些簇註釋為神經中胚層祖細胞、體節前中胚層、分化前沿和體節連續譜系的標誌基因表達；此外，還包括高級中胚層和心臟中胚層，以及脊索樣細胞和腸道/內胚層樣細胞。NMP，神經中胚層祖細胞；PSM，體節前中胚層。
sc-RNA-seq 譜的共嵌入，按人類 CS7 胚胎的註釋進行標記
96 小時時的人類 gastruloid 與小鼠胚胎（E8.5–10.5）之間的對應細胞類型
在所示共嵌入 UMAP 上，NTC 和遺傳擾動的人類 RA-gastruloid 中的標誌基因表達
我們感謝 Shendure 實驗室的成員以及 Allen 細胞譜系追蹤發現中心的成員所提供的寶貴反饋與討論；感謝 A. Boulgakov 在細胞培養實驗中的幫助；感謝 A.M. Arias、N. Moris、A. Alemany 和 SC van den Brink 的有益討論；感謝 Ali H. Brivanlou 博士提供 RUES2-GLR ESCs；並感謝幹細胞與再生醫學研究所（ISCRM）的 TOM & SUE ELLISON 幹細胞核心平台以及華盛頓大學的 KECK 顯微中心。
本研究得到 Paul G. Allen Frontiers Group 的資助（Allen 細胞譜系追蹤發現中心，資助 JS）以及美國國家人類基因組研究所的資助（UM1HG011586，資助 JS）。JS 為霍華德·休斯醫學研究所研究員。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.02.10.579769
🏷️ 原腸胚樣體 早期人類發育 神經管形成 體節分化 類器官模型 計算分期