不到一半的人類合子能夠存活至活產，主要原因是源於減數分裂或有絲分裂的非整倍體。有絲分裂錯誤會導致染色體嵌合性，其定義為存在具有不同染色體組成的多個細胞譜系。人類胚胎中染色體嵌合性的發生率及其對適合度的影響仍存在爭議，因為以往大多數研究均基於群體DNA檢測，或對少量胚胎細胞進行多次活檢比較。單細胞基因組數據為在整個胚胎尺度上定量評估嵌合性提供了機會。為此，我們擴展了一種基於基因表達中與染色體劑量相關變化推斷非整倍體的方法，並整合了等位基因失衡特徵。
我們將該方法應用於已發表的74個解離人類胚胎的單細胞RNA測序數據，這些胚胎涵蓋了從桑椹胚到囊胚階段。我們的分析顯示，在植入前發育過程中廣泛存在嵌合性非整倍體：74個胚胎中有59個（80%）至少含有一個非整倍體細胞（1% FDR）。通過對拷貝數判定結果進行聚類，我們重建了染色體錯誤分離的歷史，區分了減數分裂及早期有絲分裂錯誤與譜系分化後發生的錯誤。我們未觀察到與內細胞團相比，滋養外胚層中非整倍體細胞存在顯著富集；不過，在已發表的植入後較晚階段數據中，我們確實檢測到了這種富集。
最後，我們觀察到非整倍體細胞表現出免疫應答基因上調，以及參與增殖、代謝和蛋白質加工的基因下調，這與此前在其他發育階段和系統中記錄到的應激反應一致。總之，我們的工作提供了植入前胚胎中非整倍體的高分辨率圖景，並支援這樣一個結論：低水平嵌合性是人類早期發育的常見特徵。
研究染色體嵌合性發生率及其影響的一個主要侷限在於，大多數推斷均基於群體DNA檢測，或對少量胚胎細胞進行多次活檢比較。因此，目前對人類胚胎中嵌合性的估計範圍從4%到90%（
單細胞基因組數據集為研究嵌合性非整倍體提供了很有前景的資源，因為其中可能包含有關細胞類型和染色體拷貝數的寶貴資訊。此外，在單細胞數據中觀察到的非整倍體特徵還可能提示其起源於減數分裂或有絲分裂機制。既往研究已利用單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據檢測嵌合性非整倍體，確立了這一方法的原理可行性。
將該方法應用於來自74個胚胎的scRNA-seq數據（
一種基於互補特徵在單細胞RNA測序數據中檢測非整倍體的方法，這些特徵包括染色體範圍內的基因表達改變以及等位基因失衡。
在所有細胞類型和發育階段中，我們估計80%（74個胚胎中的59個）至少包含一個非整倍體細胞，並且在74個胚胎中檢測的全部1115個細胞中，有39%（1115箇中的433個）在1%的FDR閾值下被判定為非整倍體（
在人類著床前胚胎的scRNA-seq數據中發現的非整倍體（
基於人類胚胎scRNA-seq數據檢測到的染色體異常示例。每個熱圖代表一個獨立胚胎的數據。熱圖的行代表單個細胞，列代表染色體（僅包括常染色體）。樹狀圖展示了非整倍體特徵的層次聚類，大致反映了非整倍體細胞之間的共同祖先關係。
每個胚胎中非整倍體細胞的比例呈現出典型的“U”形，提示減數分裂來源的非整倍體（例如，
儘管我們觀察到染色體特異性非整倍體率與每條染色體上的蛋白編碼基因數量之間存在負相關（Pearson’s r = −0.546，p = 8.64 × 10
著床前遺傳學領域長期存在的問題包括：非整倍體細胞如何分佈於不同細胞類型之間，以及這種分佈如何在發育過程中發生變化。細胞類型特異的非整倍體易感性和/或耐受性，可能有助於解釋諸如在後期發育階段觀察到的侷限於胎盤的嵌合現象（
不同細胞類型間非整倍體的比較。
人類胚胎中對非整倍體的轉錄響應。
儘管scRNA-seq數據對於判定細胞類型具有資訊價值，但其稀疏且爆發式的特性給非整倍體推斷帶來了挑戰，從而在實際應用中限制了靈敏度和特異性（
利用該模型，我們鑑定出2925個在整倍體與非整倍體細胞之間差異表達的基因（5% FDR；表S2）。其中最顯著的關聯涉及該基因的上調
為了進一步深入理解人類胚胎對非整倍體的全局響應，我們對分子特徵數據庫（MSigDB）中的hallmark基因集進行了基因集富集分析。該分析揭示出20個基因集在差異表達基因分佈的尾部顯著富集（5% FDR）。值得注意的是，我們觀察到在非整倍體細胞中顯著富集上調基因的基因集較少（2個基因集），而顯著富集下調基因的基因集較多（18個基因集）。下調的基因集包括與細胞增殖、蛋白質加工和代謝相關的基因集。
在非整倍體細胞中富集上調基因的基因集包括那些受KRAS信號通路下調的基因（這再次可能反映出一種抗增殖反應），以及響應TNF-α時由NF-κB調控的基因，這與此前在非整倍體細胞系中報道的細胞應激和炎症信號總體一致（
以往大多數關於人類著床前胚胎非整倍體的研究的一個關鍵侷限在於，它們依賴於對一個或少數幾個細胞的活檢。許多研究採用了一種關於嵌合體的操作性定義，即基於PGT-A結果，其表現介於均一整倍體活檢和均一非整倍體活檢的預期結果之間（
我們試圖通過利用已發表的人類解離胚胎scRNA-seq數據來克服這些侷限。通過結合基因表達改變和等位基因失衡的特徵，我們在單細胞分辨率下揭示了減數分裂性和有絲分裂性非整倍體的模式。共有31%的胚胎在所有細胞中至少有一條染色體表現出均一或近乎均一的非整倍體，這一模式可歸因於減數分裂錯誤，而這類錯誤在很大程度上可追溯至母源卵子發生。與此同時，低水平嵌合現象在所有細胞類型和發育階段中均較為普遍，推斷有74%的胚胎至少包含一個受有絲分裂錯誤影響的細胞。
儘管這一估計值顯著高於大多數基於活檢的研究，但它與少數先前在解離胚胎單細胞中定量非整倍體的研究結果大致一致，儘管這些研究採用了不同的方法學或處於不同的發育階段。一項里程碑式研究由
我們研究中的一個令人驚訝的觀察是，發現了一個嵌合的近單倍體胚胎（胚胎E7.5），其中9個細胞中有8個似乎為單倍體或近單倍體，而另一個細胞則表現為近二倍體。這種極端形式的嵌合現象僅憑基因表達分析無法被檢測到，但基於等位基因失衡特徵則可清晰識別。已知葡萄胎約影響每600次妊娠中的1次，其中一半為三倍體雙精受精型（兩套父源染色體和一套母源染色體），另一半為二倍體雄核發育型（兩套父源染色體）。據估計，後者中約85%為單精受精，可能通過母源染色體被排出至第一極體，隨後父源染色體發生“二倍體化”而形成（
通過利用scRNA-seq數據中包含的細胞類型資訊，我們還評估了一個長期存在的問題，即不同細胞類型之間的非整倍體率如何變化。從基礎生物學和臨床角度看，這一問題都具有吸引力。此類比較不僅有助於理解基因必需性和劑量敏感性的發育圖景，也有助於闡明來源於滋養外胚層組織的PGT-A活檢的代表性。我們未檢測到非整倍體在滋養外胚層中的顯著富集，但需注意，較寬的置信區間（AME = 0.012，95% CI [-0.064, 0.087]）表明我們不能排除存在適度差異。
事實上，在成熟小鼠囊胚的滋養外胚層細胞中觀察到的約6%的非整倍體富集，由
已知非整倍體的轉錄後果並不限於直接的劑量效應，還會延伸至
這裏所描述的一項關鍵方法學進展，是整合表達改變特徵與等位基因失衡特徵，以在單細胞中檢測非整倍體。對等位基因失衡的考量增強了我們對結果的信心，尤其是在單體性情況下；單體性會在整條染色體範圍內產生單等位基因表達（同時考慮到諸如條形碼交換、偽陽性SNP以及錯誤比對讀段等技術偽影）。儘管取得了這一進展，從scRNA-seq數據中推斷非整倍體仍然具有挑戰性。
一個重要的注意事項是，表達水平和等位基因平衡相對於二倍體預期的任何偏離，都可能導致我們拒絕原假設，而除整條染色體非整倍體之外的其他現象有時也可能誘發此類偏離。例如，大規模結構變異可能會被我們的方法誤判為非整倍體。儘管我們所設定的效應量閾值有助於緩解這一問題，但明確區分片段性非整倍體與整染色體非整倍體的方法，仍是未來發展的重要方向。方法學進一步改進的其他機會還包括將基於群體的和/或基於讀段的定相整合到等位基因失衡分析中，這對於三體性的推斷可能尤其有益（
另一項需要指出的注意事項是，我們研究中分析的數據來源於相對較少患者的IVF胚胎，而關於這些患者的人口統計學或臨床資訊均未公開發表。因此，我們敦促讀者在將這些發現外推到更廣泛人群時保持謹慎。既往研究已經確立了母親年齡與植入前胚胎減數分裂錯誤發生率之間的強相關性（
非整倍體是導致人類妊娠丟失和先天性出生缺陷的首要原因（
非整倍體推斷基於染色體範圍差異表達和等位基因失衡這兩種互補特徵。差異表達特徵是軟件包的基礎
為了將觀測到的等位基因失衡比率轉換為z分數，我們首先通過迴歸消除了讀段數量對等位基因失衡的影響，因為我們觀察到，所觀測比例與用於生成這些比例的讀段數量之間存在正相關。隨後，在假設大多數細胞-染色體組合都處於原假設之下的前提下，我們將所有原假設數據點界定為：其等位基因失衡估計值位於經驗分佈第一四分位數與第三四分位數之間的數據點。接着，我們將原假設比例處的殘差估計為所有原假設數據點所生成殘差的均值。為了估計原假設下的方差，我們進一步假設這些殘差近似服從正態分佈。
在這一假設下，並結合我們已假定大多數細胞-染色體組合處於原假設之下這一前提，我們使用下式推導了原假設下等位基因失衡殘差的方差，
因此，對 σ 求解並將其平方後，我們得到上述結果。在零假設下獲得均值和方差後，我們通過從每個點中減去該均值併除以方差的平方根，將殘差轉換為 z 分數。隨後，基於單體性和三體性都會增加等位基因不平衡這一預期，我們計算了單側 p 值。
我們利用上述 scploid 和等位基因不平衡分析所得的 p 值，對每個細胞-染色體進行了總體檢驗。我們注意到，作為最後一步，
我們使用混合效應邏輯迴歸評估了細胞類型對非整倍體狀態的影響。我們擬合了兩個模型。在這兩個模型中，我們的結局變量均為指示非整倍體狀態的二元變量（若細胞具有一條或多條非整倍體染色體，則定義為非整倍體），並納入胚胎發育階段（受精後天數）作為固定效應連續變量。在第一個模型中，我們納入了細胞類型（分類變量）；在第二個模型中，我們納入了滋養外胚層細胞的指示變量（其餘所有細胞類型歸為非滋養外胚層）。我們將胚胎視為隨機效應，以解釋同一胚胎內細胞之間的相關性，並對兩個模型均估計了隨機截距。
同時，假定各胚胎彼此獨立。
針對非整倍體的全局轉錄反應，我們通過比較被判定為整倍體與非整倍體的細胞之間的差異表達進行了研究。單細胞表達計數採用以下方法進行標準化
作者聲明不存在競爭性利益。
感謝馬里蘭高級研究計算中心的工作人員提供計算支援。同時感謝非整倍體起源研究聯盟提出的重要反饋。感謝 Alexis Battle、Rong Li、Jin Zhu，以及 McCoy 實驗室成員的有益討論。本研究得到 NIH 資助項目 R35GM133747（資助對象為 R.C.M.）的支援。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.06.894287
🏷️ 單細胞RNA測序 胚胎發育 非整倍體 染色體嵌合 拷貝數變異