儘管在模式系統中已被廣泛研究，人類原腸胚形成過程仍然不甚清楚。該過程始於囊胚植入子宮壁，這通常被認為發生在受精後14天之後。胎兒生物材料的稀缺與取得受限，以及倫理方面的考量，限制了我們對人類原腸胚形成細胞與分子圖譜的理解。
培養體系的建立使得
近期研究表明，初始態人胚胎幹細胞（naïve hESCs）能夠自組織形成三維囊胚模型（
RUES2（NIHhESC-09-0013）細胞通過化學重置（chemical resetting）由植入後“預備態”（primed）重新編程為植入前“初始態”（naïve）（
經化學重編程的初始態RUES2 hESCs表現出植入前標誌基因，並能夠產生
A）對預備態（CM+FGF2）和初始態（N2B27+PXGL）RUES2 hESCs進行免疫染色顯示，在兩種條件下均表達核心多能性基因OCT4、SOX2和NANOG。免疫染色偽彩：OCT4（綠色）、SOX2（藍色）、NANOG（洋紅色）以及DAPI（灰色）。比例尺：50 μm。
B）通過免疫染色分析轉錄因子KLF17和表面標誌物SUSD2的表達，可區分初始態與預備態多能幹細胞。免疫染色偽彩：KLF17（紅色）、OCT4（綠色）、SUDS2（黃色）以及DAPI（灰色）。比例尺：50 μm。
原條和中胚層誘導過程中
A）PALLY-LY分化的明場圖像
D）10 dpa時的免疫染色顯示OCT4
G）面積定量結果以散點圖顯示。x軸表示標準化後的OCT4，y軸表示BRA標準化面積。每個點代表一個單獨附着的
採用兩個不同時間點（7和10 dpa）進行scRNA-seq分析。共鑑定出16個不同的細胞簇，包括三胚層衍生細胞和胚外細胞（
A）UMAP圖顯示了四種主要細胞身份及其特異性標誌基因：上胚層/外胚層（POU5F1/OCT4）、中胚層（VIM）、內胚層（FOXA2）和胚外外胚層（GATA3）。
B）UMAP圖展示了7–10 dpa scRNA-seq數據集中鑑定出的細胞群體，並根據分析時間和細胞註釋進行着色。熱圖顯示了7和10 dpa時區分各個細胞群體的標誌基因標準化計數。
C）UMAP圖顯示了胚外亞譜系（羊膜、細胞滋養層和合體滋養層）。z-score熱圖展示了區分羊膜（ISL1、VTCN1、GABRP）、細胞滋養層（MKI67、VGLL1、ITGA6）和合體滋養層（SDC1、ERVV-1、PSGC3）的標誌基因。上胚層/外胚層亞譜系（外胚層、上胚層、PGC和早期原始條）。
z-score熱圖展示了區分外胚層（SOX2、OTX2、CRABP1）、上胚層（KLF17、DPPA5、UPP1）、早期原始條（TBXT、MIXL1、TBXT）和PGC（SOX17、TFAP2C、NANOS3）的標誌基因。中胚層亞譜系（心臟中胚層、中胚層1-2-3、原始條2和內皮）。
z-score熱圖展示了區分原始條2（TDGF1、MESP1、WNT3）、心臟中胚層（TNNT2、TNN1、HAND2）、內皮（PECAM1、KDR、MEF2C）和中胚層3（MASP1、CD33、SLC4A8）的標誌基因。內胚層亞譜系（確定性內胚層、下胚層和卵黃囊內胚層）。z-score熱圖展示了區分確定性內胚層（OTX2、SHISA2）、下胚層（VEPH1、RSPO3）和卵黃囊內胚層（AFP、APOB）的標誌基因。
10 dpa時滋養外胚層和羊膜的胚外細胞。
對原始條細胞群的單細胞表徵
A）原始條簇的UMAP圖顯示了前部（OTX2、LHX1、HHEX）和後部（EVX1、CDX2、NKX1-2）標誌基因的表達。
B）UMAP圖顯示了Spemann組織者標誌基因（GSC、CER1、FST、NOG）的表達。
A）熱圖顯示了7和10 dpa時區分胚外（GATA3、GATA2、HSD3B1、KRT7）、上胚層/外胚層（POU5F1、NANOG、DPP5、UTF1）、中胚層（ZEB2、VIM、HAND1、CDH11）和內胚層（FOXA2、SOX17、HNF1B、HNF4A）細胞群的標誌基因的z-score標準化表達值（7 dpa：7354個細胞；10 dpa：5489個細胞）。
B）UMAP圖顯示了鑑定出的細胞群：細胞滋養層、合體滋養層、羊膜、上胚層、外胚層、始原生殖細胞、原始條1-2、中胚層1-2-3、心臟中胚層、內皮、確定性內胚層、下胚層和卵黃囊內胚層。
C）平均標準化表達熱圖顯示了區分各個細胞群的標誌基因。
隨後，我們將我們的數據集與近期發表的scRNA-seq轉錄組圖譜進行了比較，該圖譜為
A）使用Zhao等，2021年提出的Embryogenesis Prediction工具預測的細胞類型以UMAP空間中的不同顏色顯示（顏色編碼：上胚層、原始條、中胚層、內胚層、滋養外胚層和羊膜細胞群）。
D）體外貼壁培養的人類類囊胚（7和10 dpa）的scRNA-seq與小鼠原腸胚形成數據集進行了整合（
E）體外貼壁培養的人類類囊胚（7和10 dpa）的scRNA-seq與猴早期器官發生數據集進行了整合（
A）將體外附着的人類類囊胚（7和10 dpa）的 scRNA-seq 數據與人類三維培養胚胎（Xiang 等，2019）數據，使用 scanorma 及共同檢測到的高變基因進行整合。UMAP 展示了各個單獨的細胞群。來自該數據集的細胞群另標註為“hE_3D”。相關性分析以 z-score 熱圖顯示。層次聚類以樹狀圖形式展示於……之間。
B）將體外附着的人類類囊胚（7和10 dpa）的 scRNA-seq 數據與體外附着的猴胚胎數據集進行整合（
A）UMAP 顯示了 7–10 dpa 的整合結果
B）利用人類原腸胚數據集之間共同檢測到的高變基因進行相關性分析（
C）層次聚類以樹狀圖形式展示。人類原腸胚（
原腸形成的起始受一條以 BMP4 開始的信號級聯調控，隨後其誘導 WNT，而 WNT 與 NODAL 協同控制中胚層和內胚層分化（
A）scRNA-seq 分析以熱圖形式展示了……各個單獨細胞群中 BMP4、WNT3 和 NODAL 配體的平均標準化表達量
B）scRNA-seq 分析以小提琴圖形式展示了 ID2 和 LEF1 的表達水平，它們分別是 BMP 和 WNT 信號通路的即刻早期靶基因。
H）免疫染色定量分析 BRA 所佔據的面積
闡明人類原腸形成的細胞與分子邏輯，對於理解身體軸形成的基本原理以及與胚胎發育失敗相關的早期流產的潛在原因，具有重大意義。據估計，多達 30% 的全部流產發生於妊娠第二週之後（
RDS 構思了該項目，完成了人類胚胎和
A.H.B. 是 RUMI Scientific 和 OvaNova 的聯合創始人。A.H.B. 和 E.A.R.O. 是 RUMI Scientific 的股東。R.D.S.、E.R.、G.C. 和 M.Y. 聲明不存在需披露的利益衝突。
本手稿所述研究已根據大學關於涉及人胚胎幹細胞和人類胚胎研究的政策，經洛克菲勒大學機構審查委員會批准，並由三校幹細胞倡議胚胎幹細胞監督（Tri-SCI ESCRO）委員會監管。該委員會負責監督人類胚胎研究監督（EMRO），並服務於洛克菲勒大學、紀念斯隆凱特琳癌症中心和威爾康奈爾醫學院。ESCRO委員會是一個獨立機構，負責監督涉及人多能幹細胞和胚胎的研究，以確保其符合大學政策。Tri-SCI ESCRO委員會由具備科學和生物倫理學專長的成員組成。
既定ESCRO方案每年接受審查，並遵循ISSCR 2021指南。用於研究的多餘IVF來源人類胚胎由人類生殖中心和耶魯生育中心提供捐贈。胚胎捐贈通過知情同意程序完成，符合美國國家科學院（NAS）《人胚胎幹細胞研究指南》和經ESCRO審查研究的三校幹細胞研究操作程序。
人多能幹細胞培養與化學重編程 RUES2人胚胎幹細胞（hESCs，NIHhESC-09-0013）在鋪有Geltrex塗層的培養皿（ThermoFisher Scientific）上，使用添加FGF2（20 ng/mL）的MEF條件培養基（CM）維持於始發態。CM-FGF2培養基每日更換，細胞每3–5天使用Accutase或ReleSR（ThermoFisher Scientific）傳代一次。
向naïve狀態的重編程按照以下方法進行
人naïve多能幹細胞在PXGL培養基中可維持培養至25代。naïve細胞經Accutase單細胞消化後，每3–5天在MEF飼養層平板上進行傳代，所用PXGL培養基中補充ROCK抑制劑（10 μM）和Geltrex（1%）。
naïve人多能幹細胞經分化形成
冷凍保存的IVF來源人類胚胎（受精後第5–6天，5–6 dpf）按照製造商說明，使用Kitazato試劑盒（VT602US，Kitazato USA）進行復蘇。簡言之，裝有單個胚胎的細管先置於TS1溶液中1分鐘，隨後在DS2溶液中處理兩次，每次2分鐘，再在WS3溶液中處理兩次，每次3分鐘。胚胎隨後置於礦物油（FUJIFILM）覆蓋下的GLHP培養基滴（GlobalHP）中培養過夜。次日，將孵出的囊胚轉移至鋪有Laminin-521塗層的IBIDI 8孔板中，並使用IVC1培養基培養。
48小時後，將50%的培養基更換為IVC2培養基。此後每日更新50%的IVC2培養基，直至實驗結束。
第7天和第10天的樣本經酶消化獲得單細胞（Geltrex 5%）
10X Genomics文庫使用NovaSeq 6000（Illumina）進行測序，FASTQ文件採用Cell Ranger（7.0.0）比對至hg38參考基因組。Cell Ranger生成的計數矩陣在Python中使用Scanpy進行處理（
原始計數矩陣和細胞註釋可在 GEO 數據庫中取得，登入號為 GSE225893。
OCT4，Santa Cruz Biotechnology（sc-5279），1:200
GATA3，Thermo Fisher Scientific（14-9966-82），1:100
MIXL1，Sigma Prestige 抗體（HPA005662），1:200
SUSD2，Miltenyi Biotec（130-106-401），1:100
SSEA4，Miltenyi Biotec（130-122-958），1:100
GATA4，Thermo Fisher Scientific（14-9980-82），1:100
圖像採用激光掃描共聚焦顯微鏡（Zeiss Inverted LSM 780 或 Zeiss Inverted LSM 940）取得，使用 ×10、×20 乾式物鏡和 ×63 油鏡物鏡。
圖像使用 ZEN black 軟件或 Fiji_V2（Version 2.1.0/1.53c）沿 z 軸對 z-stack 進行最大強度投影（MIP）顯示。Fiji 軟件用於圖像處理、對比度調整和導出。各個通道陽性信號的面積是在經過 Ilastick 像素分類後的 MIP 圖像上計算的（
我們感謝 Brivanlou 實驗室成員提出的意見和批評。我們感謝 Rockefeller Bio-Imaging Resource Center 提供成像技術支援，並感謝 NYU Genomic Core Facility 提供測序技術支援。
我們還要感謝 Center for Human Reproduction 的 Dr. Norbert Gleicher 和 Yale Fertility Center 的 Dr. Pasquale Patrizio 為本研究提供患者捐贈的人類胚胎，並感謝 Dr. Emanuela Molinari 在胚胎處理方面提供幫助。R.D.S. 獲得了 EMBO-LTF-254-201 的資助。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.05.16.541017
🏷️ 人胚胎幹細胞 原腸胚形成 初始態多能性 體外培養 化學重編程