許多哺乳動物能夠通過在囊胚階段暫停胚胎發育來調控妊娠和分娩的時間。發育暫停的能力是否在哺乳動物中普遍保守存在，尤其是否存在於人類中，仍屬未知。調控生長的 mTOR 通路活性決定了小鼠中的發育暫停（
早期哺乳動物發育的時間可在體內通過將囊胚期胚胎自然保存於休眠狀態數週至數月而得到控制（
儘管並非所有哺乳動物都會在其生殖週期中採用滯育，但種間子宮移植實驗提示，進入滯育的能力可能普遍存在於哺乳動物之中（
人類是否存在滯育的可能性曾被提出，但迄今尚未有令人信服的證據加以證明（
我們此前已發現，mTOR 通路調控小鼠中的發育暫停（
在此，我們表明，人類模型胚胎（類囊胚，blastoids）以及多能幹細胞（PSCs）均可通過 mTORi 進入一種類似滯育的、穩定且可逆的休眠狀態。通過比較 naïve（PXGL）、naïve-like（RSeT）和 primed（mTeSR）培養條件，我們證明人類 PSCs 中存在階段特異性的滯育響應，並且其與小鼠滯育具有共同特徵。我們還發現，人類細胞表現出物種特異性的通路利用方式以及不同的休眠進程。這些結果提示，有可能通過延長植入前階段發育適能的時間窗口來調控人類早期發育的時間進程。
由於 mTOR 通路是決定小鼠囊胚處於休眠還是增殖狀態的主要調控因子，我們首先表徵了人類囊胚中的 mTOR 活性水平及其模式，並與小鼠進行了比較（
mTOR 通路響應營養物質以及環境中的某些生長因子，調控細胞生長與增殖（
為在可逆體系中穩健地檢驗人類滯育反應，我們選擇了近期建立的類囊胚模型。類囊胚是來源於胚胎幹細胞的結構，其在形態和轉錄組層面均與人類囊胚高度相似（模擬第 5 至第 7 天）（
為檢測 mTOR 抑制對人類類囊胚發育時間進程和形態的影響，首先形成類囊胚，隨後在 mTOR 抑制劑 RapaLink-1 存在條件下繼續培養（
a. 在對照條件下培養或經 mTOR 抑制劑 RapaLink-1 處理的類囊胚明場圖像。所示時間點（第 1–8 天）表示類囊胚形成後的培養時間（自 ESC 培養開始 96 h 後）。
b. 人類正常類囊胚和暫停類囊胚的明場圖像，並與延長培養的未處理類囊胚進行比較。右側面板顯示基於免疫熒光染色對 ICM 和 TE 中細胞數量的定量結果。
c. 小鼠正常及滯育囊胚（體外和體內）的明場圖像，並與擴展培養中的未經處理的類囊胚進行比較。右側面板顯示基於免疫熒光染色對內細胞團（ICM）和滋養外胚層（TE）細胞數量的定量分析。
d. 對照類囊胚以及經所示濃度 mTOR 抑制劑 RapaLink-1 處理的類囊胚的縱向形態學評分。類囊胚在結構塌陷後不再被視為完整。n = 處理的類囊胚數量。
e. 對 ICM 標誌物 OCT4 和 NANOG、TE 標誌物 GATA3 和 CDX2，以及原始內胚層（PrE）標誌物 GATA4 和 SOX17 的免疫熒光（IF）染色。共對 16 個對照類囊胚和 15 個滯育類囊胚進行了染色。15 個滯育類囊胚中有 3 個、16 個對照類囊胚中有 2 個顯示出線性組織的 PrE 層（如右上方面板所示）。
f. 滯育後的再啟用及植入後擴展培養。類囊胚經 mTOR 抑制劑處理 4 天，隨後撤除 mTOR 抑制劑，並將類囊胚接種於 Matrigel 包被的培養板上培養（
在子宮內，滯育胚胎在接收到生長信號後會重新啟用並完成植入。為檢驗 mTOR 抑制劑誘導的滯育是否同樣可逆，我們在經 mTOR 抑制劑處理 2–6 天后對滯育類囊胚進行再啟用，並進一步將其置於 Matrigel 包被的培養板上培養（
我們此前已證明，在 mTOR 抑制條件下的小鼠初始型多能幹細胞（PSC）能夠忠實模擬滯育上胚層，包括高度的轉錄相似性（
小鼠和人類 PSC 均可在體外獲得，表現出初始型或始發型多能性的分子與表觀遺傳特徵以及形態學特性，這些特性分別反映囊胚（
引人注目的是，在 PXGL 條件下培養的人類初始型 PSC 對小鼠胚胎幹細胞（ESC）表現出類似反應，並穩定進入一種增殖較低且可逆的多能狀態。在 mTOR 抑制條件下，初始型 PSC 可維持 18 天（測試的最長時間），隨後可解除抑制並反覆再次誘導滯育，而不損害集落形態（
迄今為止，小鼠和人類 PSC 均使用 mTOR 抑制劑 INK128 進行滯育處理，因為先前研究表明該抑制劑可有效在小鼠 ESC 中誘導一種類似滯育的狀態（
到目前為止，我們的結果表明，人類 PSC 以及類囊胚均具有進入滯育狀態的能力，且這種滯育在功能上是可逆的。接下來，我們旨在從分子層面探究滯育可逆性，鑑定相關通路，並更全面地比較 PXGL 和 RSeT 條件。為此，我們收集了正常、穩定滯育和釋放後的細胞，並進行了無標記定量蛋白質組學質譜分析（
為了探究哺乳動物中可能保守的滯育反應，我們進一步比較了小鼠和人類初始型 PSC 在進入休眠狀態的細胞轉變過程中其時間動態和通路利用情況。為此，我們在小鼠和人類中收集了最長達 10 天的匹配時間點樣本，並進行了蛋白質組學分析（
小鼠和人類的發育時鐘本質上是不同的，因此我們想知道，在這些物種中，滯育是否以相似或不同的速度建立。縱向樣本的相關矩陣顯示，人類和小鼠細胞中存在不同的“斷點”，在此之後，暫停的蛋白質組特徵趨於穩定（人類 = d6，小鼠 = d2，
一旦穩定下來，人類和小鼠的暫停蛋白質組在蛋白水平和通路水平上表現出相關性（
最後，我們試圖利用囊胚樣體模型，驗證基於暫停狀態人類PSC蛋白質組分析所預測的物種特異性代謝需求。蛋白質組分析指出，脂肪酸是小鼠特異性的能量來源，用於維持暫停狀態（
眾所周知，人類胚胎在早期發育進程中的推進能力存在顯著變異，據估計，約有1/3的妊娠會在孕早期因遺傳和非遺傳異常而失敗（
一旦建立並穩定，暫停狀態的hPSC和囊胚樣體在撤除mTORi後可輕易重新啟用。然而，初始的naïve和naïve-like hPSC群體在進入暫停狀態的能力方面表現出異質性。這種異質性的根本原因仍有待探索。我們推測，細胞進入暫停狀態時的轉錄狀態或細胞週期階段可能是影響因素（
近年來，受調控的翻譯已成為連接幹細胞活性與微環境的重要新參與者（
ABK和DPI構思了該項目。DPI建立了人類PSC暫停模型並完成了所有幹細胞實驗。VAvdW進行了計算分析和小鼠胚胎染色。HHK在NR指導下進行了囊胚樣體實驗。ID和EGS提供了資源。AM、TR、CSS和SEW在KKN監督下進行了人類胚胎實驗。KE、PS和LC協調了胚胎捐獻。ABK監督了整個項目。DPI、VAvdW、NR和ABK撰寫了手稿，所有作者均提供了反饋。
在PXGL和RSeT培養條件下，正常、暫停（d6）和釋放後人類細胞中多能性相關基因OCT4及細胞分裂標誌物H3S10p的水平。右側面板顯示了所有采集圖像的單細胞定量結果。n表示分析的細胞數。比例尺，50 mm。所採用的統計檢驗為單因素方差分析（one-way ANOVA），並進行了Tukey多重比較校正。
mTOR下游靶標pS6和pAKT的免疫熒光染色。底部面板顯示按面積歸一化的單細胞染色強度定量結果。虛線：中位數；點線：四分位數。比例尺，50 mm。所採用的統計檢驗為雙尾Kolmogorov-Smirnov t檢驗。
在人類受精與胚胎管理局（Human Fertilization and Embryo Authority，HFEA）許可證編號 R0162 的監管下，研究項目通過知情同意獲得了人類胚胎捐贈。該項目還獲得了英國衛生研究管理局劍橋中央研究倫理委員會的批准，IRAS 項目編號為 272218（劍橋中央參考編號 19/EE/0297）。審批過程包括獨立同行評審，以及 HFEA 執行許可小組和執行委員會的批准。我們的研究符合 HFEA《操作規範》，並自許可證獲批以來接受了 HFEA 的獨立檢查。
患者同意由 Bourn Hall Clinic 取得。所有在體外受精（IVF）治療後捐贈剩餘胚胎的夫婦均簽署了知情同意。在簽署同意之前，捐贈者獲得了有關該研究項目的所有必要資訊、接受諮詢的機會，以及許可證和 HFEA《操作規範》中適用條件的詳細說明。具體而言，患者簽署了同意書，授權將其胚胎用於研究，包括幹細胞建系，並允許將這些研究結果發表於科學期刊。捐贈未提供任何經濟誘因。提供給患者的資訊說明書和知情同意文件可公開取得（
凍存在細管中的玻璃化胚胎通過將細管內容物從液氮中快速直接轉移至復甦液（Irvine Scientific Vitrification Thaw Kit）中進行復蘇，並按照製造商說明操作。凍存在 cryopet 中的胚胎先於 37 °C 水浴中復溫 3 秒，然後轉移至復甦液（Irvine Scientific Vitrification Thaw Kit）中。凍存在玻璃安瓿中的胚胎則在液氮條件下去除瓶頂後，於 37 °C 水浴中完全復甦。
隨後將內容物倒入培養皿中，並按照製造商說明，將胚胎依次轉移通過蔗糖溶液梯度（Quinn’s Advantage Thaw Kit，Origio）。胚胎常規培養於 Global Media 中，補充 5 mg/mL LifeGlobal Human Protein Supplement（均為 LifeGlobal），並於 37 °C、5% CO₂ 培養箱中預平衡過夜。
根據《德國幹細胞法》的要求，所有涉及人胚胎幹細胞（hESCs）和/或 hESC 來源胚泡樣體的實驗均獲得了柏林羅伯特·科赫研究所和奧地利科學院科學倫理委員會的批准。Wicell 的 H9 細胞系依據協議 20-WO-341 用於題為“模擬人類早期發育：建立基於幹細胞的人類囊胚（三維）體外模型（blastoids）”的研究項目。儘管就胚胎模型而言，ISSCR 指南並不禁止這一點，但本研究並未超過通常與受精後連續培養 14 天相對應的發育階段。
所有實驗均符合所有相關指南和法規，包括 2021 年 ISSCR 指南；該指南禁止將人類胚泡樣體移植入任何子宮（
所有動物實驗均按照當地動物福利法律進行，並獲得地方主管部門批准（涵蓋 LaGeSo 許可證 ZH120、G0284/18 和 G021/19，以及英國本土事務部項目許可證（70/8560）），並在《1986 年動物（科學程序）法》規定的條件下開展。小鼠飼養於獨立通風籠中，自由攝食。
野生型 Zip13k2 雌性 hiPSCs 在無飼養層條件下培養於 Matrigel 包被板（Corning，354277）上，使用 mTeSR 培養基，並在接種當天補充 10 mM ROCK 抑制劑（ROCKi）（Tocris，1254）。復甦後次日撤去 ROCKi，每日更換培養基，每四天傳代一次。每次傳代時，細胞用 EDTA 以團塊形式解離，並按 1:5 的分瓶比例重新接種，同時加入 10 mM ROCKi。細胞維持於 37°C、20% O
為獲得 naïve-like 細胞，將 primed hiPSCs 以中等密度（75% 匯合的 10 cm 培養皿的 1:3–1:4）接種於 Matrigel 包被培養皿（Corning，354277）上，並在 37°C、20% O 條件下於 mTeSR 培養基中培養 24 小時
H9 hESCs 培養於明膠包被板上，板中包含經絲裂黴素處理的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）飼養層，培養基為 PXGL。PXGL 培養基由 N2B27 基礎培養基配製，並補充 PD0325901（1 µM，MedChemExpress，HY-10254）、XAV-939（2 µM，MedChemExpress，HY-15147）、Gö 6983（2 µM，MedChemExpress，HY-13689）以及人白血病抑制因子（hLIF，10 ng ml
小鼠胚胎幹細胞（mouse ESCs）接種於 0.1% 明膠包被培養皿上，在高糖 DMEM/Glutamax 培養基（Thermo，31966047）中培養，培養基補充 15% FBS（Thermo，2206648RP）、1X NEAA（Thermo，11140-035）、1X β-巰基乙醇（Thermo，21985023）、1X 青黴素/鏈黴素（Life Technologies，15140148）和 1000U/mL LIF，並在 37°C、20% O
對於 primed hiPSCs 的暫停培養，細胞在 mTeSR 培養基中用催化型 mTOR 抑制劑 INK128（MedChemExpress/Biozol，MCE-HY-13328）處理，終濃度為 200 nM，並加入 10 mM ROCKi，處理 1 天。次日撤去 ROCKi，隨後細胞在含 INK128 的培養基中繼續培養 6 天，並每日更換培養基。
對於在 RSeT 培養條件下 hiPSCs 的暫停培養，10
對於在 PXGL 培養條件下使 hESCs 進入暫停狀態，計數 400,000 個細胞，並將其接種到鋪滿的 MEFs 上，培養於含 10 mM ROCKi、Matrigel 和 200 nM INK128 的 PXGL 培養基中 1 天。次日用含 PXGL 和 200 nM INK128 的培養基更換培養液。
為驗證 INK128 介導的暫停狀態，使用 200 nM 的 RapaLink-1（Biozol, APE-A87764）以及 200–1000 nM 的 Torin1（Abcam, ab218606）。
對於小鼠 ESCs 的暫停處理，細胞以 200 nM 終濃度的 mTOR 抑制劑處理，並培養 6 天。根據需要補充培養基。
對於胚胎收集，採用 F1（C57Bl/6xCBA）雌鼠進行超排卵以獲得受精卵。將超排卵雌鼠與 8 周齡或以上的 F1（C57Bl/6xCBA）雄鼠交配。E0.5 胚胎從腫脹的輸卵管壺腹部採集於 FHM 培養基（Millipore #MR-024-D;27:50）中，經透明質酸酶（Sigma-Aldrich; H4272）處理以去除卵丘細胞，隨後將胚胎置於預平衡的 KSOM 培養基液滴中培養，液滴上覆蓋礦物油（Origio; ART-4008-5P），培養條件為 37.5°C、5% CO2。
體內滯育通過 CD1 小鼠自然交配後誘導。妊娠雌鼠於 E3.5 行卵巢切除術，之後每隔一天皮下注射 3 mg 醋酸甲羥孕酮。滯育胚泡在 EDG7.5、經歷 3 天滯育後，用 M2 培養基自子宮中沖洗獲得。
細胞培養於玻璃蓋玻片上，在室溫下用 4% PFA 固定 10 min，以 PBS 清洗 1 次，隨後在冰上用 PBS 中 0.2% Triton-X100 透化 5 min。以 PBS-T（含 0.2% Tween-20 的 PBS）清洗 1 次後，細胞在封閉液（PBS-T、2% BSA 和 5% 山羊血清（Jackson Immunoresearch/Dianova, 017-000-121））中於室溫封閉 1 h。
隨後細胞於 4°C 過夜孵育以下一抗：pS6（CST，貨號：4858）1:200，pAKT（CST，4060T）1:200，KI67（BD Pharmingen，556003）1:400，H3 phosphoS10（Abcam，ab5176）1:1000，OCT4（Santa Cruz，sc5279）1:50，NANOG（Abcam，ab109250）1:200，gH2A.X（Biolegend，613405）1:400。
細胞隨後以洗滌液（PBS-T，2% BSA）清洗 3 次，每次 10 min。將偶聯 Alexa Fluor 的抗兔（Thermo，A10042）或抗鼠（Thermo，21202）二抗按 1:700 稀釋於封閉液中加入細胞，在室溫下孵育 1 h，隨後再以洗滌液清洗 3 次，每次 10 min。之後使用含 DAPI 的 Vectashield（Vector labs，H-2000）封片，並用指甲油封固。
成像採用 Zeiss LSM880 Airy 顯微鏡的 Airy scan 模式完成，圖像處理使用 Zen black 和 Zen blue 軟件（版本 2.3）。圖像定量分析使用 CellProfiler（版本 4.2.1）進行，其中將細胞核或細胞定義為初級對象，並測定相應蛋白染色相對於細胞核或細胞面積的標準化強度。
人胚胎在4°C條件下於PBS中的4%多聚甲醛中固定1 h，小鼠胚胎則在室溫下固定10 min。胚胎先用PBS清洗一次，隨後用含0.5% Triton X-100的1× PBS進行透化，然後在封閉液［含0.1% Triton X-100的1× PBS中加入10% FBS］中於室溫旋轉振盪器上封閉1–2 h。隨後將胚胎置於用封閉液稀釋的一抗中，在4°C旋轉振盪器上孵育過夜。
次日，胚胎在室溫旋轉振盪器上用含0.1% Triton X-100的1× PBS清洗一次，然後在避光條件下，於室溫旋轉振盪器上用封閉液稀釋的二抗孵育1 h。胚胎隨後用含0.1% Triton X-100的1× PBS清洗，並用DAPI進行復染。
所用抗體及稀釋倍數如下：anti-pS6（Cell Signaling，4858）1:250，anti-OCT4（Santa Cruz，5279）1:50，anti-Nanog（R&D，AF1997）1:200，anti-CDX2（BioGenex，MU392-UC）1:100，anti-pAKT（CST 4060T）1:100，anti-4EBP1（CST 2855）1:100，anti-Lamin B1（Abcam ab16048）1:100，以及anti-GATA3（R&D AF2605）1:200。
所有二抗均為Alexa Fluor（Life Technologies）標記、來源於驢，使用稀釋度為1:200至1:1000。成像時，將胚胎置於PBS中的µ-Slide 18 Well Flat培養皿（Ibidi，81826）上，使用Leica Sp8共聚焦顯微鏡及Leica HCX PL APO 63x / 1.3 GLYC CORR CS物鏡進行成像。z軸層掃步長為3.5–5 mm。小鼠胚胎的成像使用Zeiss LSM880 Airy顯微鏡並採用Airy scan模式完成。
用於凋亡檢測時，收集了貼壁細胞以及懸浮細胞。細胞使用TrypLE消化分散，經冷PBS清洗後，重懸於Annexin結合緩衝液（10 mM HEPES、140 mM NaCl和2.5 mM CaCl
為研究細胞週期分佈，採用Click-iT EdU Alexa Fluor 488流式細胞術檢測試劑盒（Thermo Fisher，C10425）。正常和暫停狀態的iPSC在37°C、5% O
每個樣本取5000個細胞，在變性緩衝液中裂解，隨後進行還原和烷基化處理，並依次用Lys-C和胰蛋白酶消化。每份樣本中來源於約1000個細胞的肽段按照製造商說明加載至Evotips Pure（Evosep，丹麥歐登塞）。肽段分離採用納升級反相液相色譜（Evosep One，Evosep）進行，使用Endurance色譜柱（15 cm × 150 µm內徑，填料為Reprosil-Pur C18 1.9 µm微珠，#EV1106，Evosep），並採用每日30個樣本的方法（30SPD）。
液相色譜系統在線聯用timsTOF SCP質譜儀（Bruker Daltonics，德國不來梅），採用數據非依賴採集（DIA）結合並行累積串行碎裂（PASEF）方法（
蛋白質組學樣本製備按照已發表方案進行，並作了少量修改（
採用納升級流速反相液相色譜（Dionex Ultimate 3000，Thermo Scientific）聯用在線 Q-Exactive HF Orbitrap 質譜儀（Thermo Scientific）進行 LC-MS/MS 分析，如前所述（
原始質譜數據使用 MaxQuant 軟件（v1.6.10.43）進行處理，並基於 2019 年 8 月發佈、包含 55,153 個條目的小鼠蛋白質組數據庫 UniProtKB 進行檢索。經 MaxQuant 處理後的輸出文件見表 S1，顯示了肽段和蛋白質鑑定結果、登入號、蛋白質序列覆蓋率（% sequence coverage）、q 值以及無標記定量（LFQ）強度。
在 R 中使用蛋白質組學數據差異富集分析軟件包 DEP（v1.16.0）進行蛋白質組學數據預處理和統計分析（
蛋白質組譜的整體變化通過正常狀態與暫停狀態 iPSC 的平均 LFQ 值進行展示，並使用 ggplot2 生成。
為鑑定富集的生物學過程，對差異表達蛋白（DEPs）中 p.adj < 0.05 且 |log2FC| > 1 的蛋白應用 clusterProfiler R 軟件包中的基因本體論分析（
在人（PXGL）和小鼠數據中共有 2861 種蛋白質被表達。該對數
對數據進行了篩選，僅保留在至少一種條件下兩個樣本中均有表達的蛋白質。使用 DEP 軟件包對數據進行標準化，並通過從以最小值為中心的高斯分佈中隨機抽樣對缺失值進行插補。利用在人和小鼠 ES 細胞中均表達的蛋白質，採用 R（version 4.2.1）中的 destiny 軟件包（v3.10）計算擴散映射偽時間。物種特異性數據則使用 destiny 軟件包基於排序後的擴散組分生成偽時間。
Naive hPSC 在 37°C、5% O 的培養箱濕潤條件下進行培養
暫停狀態的類囊胚通過在先前已發表的人類類囊胚擴展培養條件下培養而被重新啟用（
採用口吸管收集類囊胚，並轉移至U形底96孔板（Merck，BR701330）中。待結構沉降後，用PBS清洗培養基兩次，並於室溫下用4% PFA固定30 min，隨後用PBS清洗三次，每次10 min。使用含10%正常驢血清和0.3% Triton X-100的PBS於室溫下封閉並透化3 h。將一抗置於封閉/透化液中，在4 °C條件下輕柔振盪孵育，並隨後使用含0.1% Triton X-100的PBS清洗至少三次，每次10 min。
二抗以含0.1% Triton X-100的PBS稀釋後，於室溫避光孵育1 h。隨後，類囊胚用含0.1% Triton X-100的PBS清洗三次，每次10 min，並準備成像。成像時，將類囊胚置於玻底培養板中。類囊胚的共聚焦免疫熒光圖像使用配備Yokogawa W1旋轉盤的Olympus IX83顯微鏡採集（軟件：CellSense 2.3；相機：Hamamatsu Orca Flash 4.0）。
共聚焦圖像使用FIJI 1.53k或Bitplane IMARIS 9.7.0軟件進行分析，並導出展示圖像。細胞計數使用Bitplane IMARIS軟件進行。通過設置體素的大小和熒光強度參數，隨後利用IMARIS的spot功能獲得每幅圖像的總體細胞計數數據。
我們感謝Bulut-Karslioglu實驗室成員、Ludovic Vallier、Michelle Percharde和Helene Kretzmer提出的重要反饋，感謝MPIMG科學平台提供的卓越服務，感謝Jennifer Shay和Cordula Mancini的協助，感謝Beata Lukaszewska-McGreal進行蛋白質組樣本製備。
本項目得到以下資助：DPI獲得德國學術交流中心（DAAD）博士獎學金（91730547）；VAvdW獲得瑞士國家科學基金會Early Postdoc.Mobility獎學金（P2EZP3_195682）；TR獲得Wellcome HDBI initiative（英國人類發育生物學倡議，360 G-Wellcome-215116_Z_18_Z）資助；NR獲得歐盟“地平線2020”研究與創新計劃下歐洲研究委員會（ERC）資助（ERC-Co grant agreement no.101002317，“BLASTOID：早期人類胚胎發生的發現平台”）；HHK獲得奧地利科學基金（FWF）Lise Meitner項目（項目編號M3131-B）資助；EGS和ABK獲得馬克斯·普朗克學會資助，ABK另獲Sofja Kovalevskaja獎（洪堡基金會）資助。
KKN實驗室的研究工作得到Francis Crick Institute支援，該研究所的核心經費來自Cancer Research UK（FC001120）、英國醫學研究委員會（UK Medical Research Council，FC001120）和Wellcome Trust（FC001120）。為實現開放取得，作者已對因本次提交產生的任何作者接受稿版本適用CC BY公共版權許可。
作者排序有誤，現已更正（PDF中未更改，但網頁中已更改）。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.05.29.541316
🏷️ 胚胎滯育 人類早期發育 mTOR通路 類囊胚 多能幹細胞