胚胎幹細胞（ESCs）能夠自組織
通過利用胚胎幹細胞的無限潛能及其自組織行為來工程化構建基於幹細胞的胚胎模型（SEMs），哺乳動物胚胎發生研究正不斷開闢新的前沿領域[
當前生成SEMs的方法依賴於以下部分或全部策略：（i）ESCs的隨機分化[
通過外源性過表達決定細胞命運的轉錄因子編碼序列，已被廣泛用於細胞的可控分化或重編程。然而，染色質背景、輔助因子的存在、過高的表達水平以及表觀遺傳屏障，都可能限制外源轉錄因子的活性。我們假設，直接利用CRISPR啟用內源性調控元件，能夠克服與胚胎幹細胞分化相關的表觀遺傳屏障[
作為對照，我們使用了表達非靶向對照sgRNA的小鼠胚胎幹細胞（sgCtrl-mESCs），以及未接受多西環素處理的細胞（
內源性調控元件活性的變化與胚胎細胞分化以及發育過程中空間有序模式的形成密切相關。我們假設，啟用最少數量的關鍵發育調控元件就足以形成空間有序的胚胎模式。為檢驗這一假設，我們將等量混合的sgGata6-mESCs、sgCdx2-mESCs和sgCtrl-mESCs接種於圓形微圖案上，以形成大小可重複的細胞集落[
空間有序的胚胎模式如何從少數隨機定位的單個細胞中產生？為回答這一問題，我們採用單細胞活體熒光成像來監測在CRISPRa編程的二維胚胎模式中空間組織形成的動態過程。為了對每一種CRISPRa誘導的細胞類型進行熒光可視化，我們設計了新的構建體，其中針對Cdx2的sgRNA與Clover-NLS共表達，而針對Gata6的sgRNA與mCherry-NLS共表達（
為檢驗這種增強的細胞運動是否伴隨方向性，我們量化了單個微圖案區域內細胞的角向運動。結果表明，與未誘導的sgGata6-mESCs和sgCdx2-mESCs相比，CRISPRa誘導細胞隨時間表現出不同的角向運動模式，這種差異在sgGata6-mESCs中更為顯著。誘導的sgGata6-mESCs在運動距離和運動方向上的集體變化，可能是這些細胞在組織形態發生過程中自我組織形成環狀結構所必需的（
基於我們的發現，即CRISPRa誘導的胚胎細胞能夠容易地形成具有空間組織性的二維圖案，我們推斷該方法可通過形成三維類胚胎結構，更加接近地重現天然胚胎發育模式。為此，我們將sgGata6-mESCs、sgCdx2-mESCs和sgCtrl-mESCs按1:3:1的比例接種於AggreWell 400培養板中。該體系通過將細胞限制於具有確定尺寸的微孔中，提高了三維細胞聚集體在大小和形狀上的一致性。我們在CRISPRa誘導72小時後進行了免疫染色和共聚焦成像，以觀察三維結構的空間組織（
起始細胞1:3:1（sgCtrl-:sgCdx2-:sgGata6-mESCs）的比例已被證明是先前發表的胚胎模型中的最佳條件[
我們對三維模型進行的定量單細胞圖譜分析表明，CRISPRa誘導的細胞系能夠容易且高效地自組織形成CPEMs，其空間特徵與受精後第5至6天的小鼠胚胎相似，也與先前報道的小鼠胚胎模型相似[
為檢驗CRISPRa誘導細胞中單個細胞的分化狀態，我們對來源於混合細胞群的CPEMs進行了單細胞RNA測序（scRNA-Seq）；同時作為對照，也對分別由各CRISPRa誘導細胞系單獨形成的CPEMs進行了測序：僅sgCtrl-mESCs、僅sgGata6-mESCs以及僅sgCdx2-mESCs。對混合CPEMs的單細胞轉錄組數據進行無監督降維分析後，解析出6個聚類，這些聚類可根據CRISPRa誘導靶基因的表達清晰地區分開來（
為進一步驗證單一細胞類型CPEMs免疫染色數據所得結果，我們還分析了僅由單一細胞類型生成的CPEMs的轉錄譜。與此一致，我們觀察到僅由sgCtrl-mESCs生成的CPEMs缺乏分化（
我們設計該胚胎模型時，使三種細胞類型均從未分化的多能狀態起始，並在接種細胞時通過誘導CRISPRa共同發育形成類胚胎結構。我們還排除了通過培養基中的重組蛋白或小分子遞送外源刺激的做法，因為這些因素可能會對CRISPRa誘導的分化產生偏倚。我們假設，CRISPRa誘導細胞的共同發育能夠促進三種細胞類型在自組織形成空間上彼此區分的胚胎圖案過程中發生持續的信號串擾[
為分析不同細胞類型聚類之間潛在的信號通路配體-受體相互作用，我們使用了CellChat[
與大多數隨機過程一樣，ESC的隨機分化無法精確控制構成胚胎模型的不同細胞類型的初始細胞組成，從而導致細胞組成和空間排列出現不同程度的變異性。對外源性分化線索的依賴，而這些線索在不同細胞類型之間往往彼此不相容，削弱了不同胚胎細胞類型在胚胎模型中的共同發育能力，因而無法充分捕捉天然胚胎發育過程中生理性的異質細胞信號傳導[
此外，誘導的轉錄因子不會經歷自然的轉錄後加工過程，如RNA剪接。隨着利用不同物種基於幹細胞的胚胎模型研究哺乳動物胚胎發生這一領域不斷開闢新前沿，亟需對現有方法加以補充和改進，以便以簡便且可控的方式生成胚胎模型，並提高其空間模式和細胞組成的可重複性[
我們研究中的一個有趣發現是，在多能細胞中僅內源性啟用兩個決定細胞命運的轉錄因子調控元件，就足以使細胞自組織形成胚胎樣模式。基於這一簡單原理，我們提出了一種直接的、基於CRISPR的表觀基因組啟用方法，在小鼠胚胎幹細胞中誘導不同細胞命運，並使其自組織形成胚胎模型。
只需將表達兩種命運誘導性向導RNA的兩類細胞，即Gata6、Cdx2以及非靶向對照，在不添加任何外源性線索的簡單生長培養基中混合，我們就在3D培養模型中觀察到清晰的空間組織：原始內胚層細胞（sgGata6-mESCs）包圍着滋養層（sgCdx2-mESCs）和上胚層細胞（sgCtrl-mESCs）的內層，並伴隨腔體形成。
有趣的是，我們發現sgGata6誘導的類原始內胚層細胞在CPEMs的模式形成中發揮主要作用，這一點可由以下事實表明：當這些細胞不存在時，模式形成完全喪失；並且sgGata6細胞自身即可生成具有腔體的結構，這與既往關於Gata6在小鼠早期胚胎發育過程中細胞命運決定中發揮重要作用的研究結果一致[
我們對二維圖案的延時熒光顯微成像揭示了細胞引人入勝的集體行為，這些行為導致了自組織有序結構的形成。集體遷移的類PrE細胞的活躍增殖導致整個結構周圍形成環狀圖案，而類TS細胞則聚集在一起，在結構內部形成局部簇，並且與類Epi細胞清晰分離。本質上，我們的結果表明，內在的細胞命運決定能夠編碼分子程序，這些程序通過細胞的集體運動與差異性生長的耦合，促成發育圖案的形成。
重要的是，我們表明結構的尺寸會影響自組織過程：類PrE細胞僅能在直徑為80 μm或140 μm的較小生長區域中實現可重複的組織化，而在225 μm或500 μm的區域中則不能。這表明，在適宜的局部環境中，受協調的細胞運動、生長以及異質細胞間信號傳導足以誘導形成自組織的類胚胎結構，而無需額外向培養基中加入形態發生素。
CPEM在分子層面上與近期發表的iETX和sEmbryo模型表現出相似性，在這些模型中，分別通過Gata6或Gata4的異位表達，或Cdx2的異位表達來生成PrE細胞或TS細胞。此外，CPEM還與培養3–4天的iETX胚胎模型相似，無論是在組織結構、細胞數量還是細胞比例方面均是如此[
我們預見，CPEM在未來實驗中將具有多種應用，可用於研究功能性基因組元件如何塑造胚胎發育過程中的整體形態、細胞組成以及信號串擾。將一種可編程蛋白CRISPRa整合到胚胎模型中，將有助於開展大規模篩選，以檢驗主要細胞命運決定因子、增強子及信號因子在胚胎模型中空間圖案形成中的作用。此外，我們的CRISPRa裝置具有可誘導性，這將使得在胚胎模型中對調控元件的啟用實現時間上的精確控制。我們也認識到該方法存在一些不足，這些問題可在未來將基於CRISPR的表觀基因組編輯器應用於胚胎模型構建時加以解決。
在我們的模型中，由Cdx2誘導產生的TS細胞在總數量上的貢獻似乎略低，並且相對於Epi和PrE細胞，其發育時序可能也略有延遲，因為它們仍維持着殘餘水平的多能性因子。我們預計，通過啟用多個TS富集轉錄因子的調控元件，可以生成發育程度更高的TS細胞。基於這一觀察，我們進一步預期，利用諸如Cas12a這類可多重化的CRISPR同源系統靶向多個元件，能夠提高胚胎模型中分化的保真度和時序一致性[
小鼠胚胎幹細胞（mESC）在 2i+Lif 條件下培養，所用培養基為 ESGRO-2i 培養基（MilliporeSigma，SF016-200）+1x Pen/Strep（Thermo Fisher Scientific，15140122），或添加了 1x Pen/Strep（Thermo Fisher Scientific，15140122）、1uM PD0325901（StemRD）、3uM CHIR99021（StemRD）和 1000 U/ml Lif（MilliporeSigma，ESG1107）的 N2B27 培養基（Takara，Y40002）。
mESC 在經 0.1% 明膠（Sigma G1890）包被的組織培養處理平板上生長。常規傳代時，細胞以每 cm² 5,000–10,000 個細胞的密度接種。
為整合 PB-TRE3G-dCas9-VPR 盒（dCas9-VPR）（Addgene，#63800），使用 Lipofectamine Stem（Thermo Fisher Scientific，STEM00003）進行細胞轉染，並以 OptiMEM（Thermo Fisher，31985062）稀釋。簡而言之，mESC 按前述方法接種於經 0.1% 明膠包被的 6 孔板中，每孔接種 300,000 個細胞。
次日，用以下以 OptiMEM 稀釋的質粒對細胞進行轉染：PiggyBac Transposase（200 ng）、dCas-VPR（800 ng）和 pUC19（1000 ng）。作為非整合對照轉染，採用以下條件：dCas-VPR（800 ng）和 pUC19（1200 ng）。轉染後 6 小時更換培養基。轉染後 48 小時，通過加入 100 ug/ml Hygromycin（Mirus Bio，MIR5930）篩選成功整合的細胞，持續 4 天，或直至對照細胞全部消失。
pSLQ1371-sgRNA 盒（Addgene，121425）通過慢病毒轉導進行整合。為製備慢病毒，將 HEK293T 細胞接種於 6 孔板中，每孔密度為 500,000 個細胞，培養基組成為 DMEM+Glutamax（Thermo Fisher Scientific 10566024）、1x Pen/Strep（Thermo Fisher Scientific，15140122）和 10% HIFBS（Thermo Fisher Scientific，10438026）。
次日，每孔將培養基更換為 2 ml DMEM+Glutamax（Thermo Fisher Scientific 10566024）和 10% ESC qualified FBS（MilliporeSigma，ES-009-B）。隨後，使用 Turbofect（Thermo Fisher Scientific）並採用以下質粒進行轉染：VSVG（300 ng）、DR8.74（450 ng）、pSLQ1371-sgRNA（750 ng）。
轉染後 6 小時，加入 1 ml DMEM+Glutamax（Thermo Fisher Scientific 10566024）、3x Pen/Strep（終濃度為 1x）（Thermo Fisher Scientific，15140122）以及 10% ESC qualified FBS（MilliporeSigma，ES-009-B）。轉染後 72 小時收集培養基於離心管中以取得慢病毒，隨後以 500 rcf 離心。
接着，將上清液通過 0.45 um 濾膜（MilliporeSigma，SLHVM33RS）過濾，並收集至新的離心管中。
對於慢病毒轉導，將mESCs以每孔50,000個細胞的密度接種於預先包被0.1%明膠的6孔板中。次日，將培養基更換為1 ml 2i+Lif培養基和1 ml預製慢病毒。慢病毒孵育24小時後，再次將培養基更換為僅含2i+Lif的培養基。為篩選已轉導細胞，在慢病毒轉導48小時後加入0.8 ug/ml嘌呤黴素（Stemcell Technologies，73342），並持續添加4天，或直到對照細胞（未轉導細胞）全部消失。
採用上述方法，構建了3株mESC細胞系，分別攜帶對照非靶向gRNA、靶向Gata6的gRNA以及靶向Cdx2的gRNA[
為驗證這3株CRISPRa細胞系，通過免疫熒光染色誘導靶基因表達。將mESCs接種於包被0.1%明膠的24孔板中。根據實驗持續時間，按以下密度接種細胞：24小時處理，每孔50,000個細胞；48小時處理，每孔25,000個細胞；72小時處理，每孔12,500個細胞；96小時處理，每孔6,250個細胞。每次染色中，sgCtrl-mESC、sgGata6-mESC和sgCdx2-mESC均重複接種，以分別進行多西環素處理和無多西環素對照處理。
細胞接種於標準分化培養基中：DMEM+Glutamax、15% ESC認證FBS、1×丙酮酸鈉（Thermo Fisher，11360070）、1×非必需氨基酸（Thermo Fisher，11140050）、1×青黴素/鏈黴素以及0.1 mM β-巰基乙醇（Thermo Fisher，21985023）。在處理孔中加入終濃度為0.5 ug/ml的多西環素（Millipore Sigma，D5207）。每24小時更換一次培養基，直至進行免疫熒光染色。
細胞處理方法如下：加入0.4 ml溶於1×PBS中的3.6%甲醛（Avantor，JTS898-7），於室溫孵育10分鐘。每孔用1×PBS清洗兩次，隨後加入溶於1×PBS中的0.2% Triton-X100（VWR，97063-864）孵育20分鐘。每孔再用1×PBS清洗一次，隨後加入0.4 ml封閉液，在室溫孵育1小時；封閉液組成為1×PBS中的3% BSA + 0.1% Triton（封閉液）。
移除封閉液後，每孔加入0.4 ml一抗孵育液，其組成為1×PBS中的1% BSA，並按下表所示加入相應稀釋比例的抗體。培養板於4°C孵育過夜。
第二天，移除一抗孵育液，孔用含 0.1% Tween 的 1x PBS 清洗兩次，再用 1x PBS 清洗一次。使用 0.4 ml 二抗溶液，其組成為 1x PBS 中含 1% BSA，並按下表所示加入稀釋後的抗體。平板於室溫孵育 1 小時。移除二抗溶液後，用含 0.5 ug/ml DAPI + 0.1% Tween（BioRad，1610781）的 1x PBS 孵育各孔 5 分鐘。孔先用含 0.1% Tween 的 1x PBS 清洗一次，再用 1x PBS 清洗兩次。
成像前，每孔加入 0.5 ml 1x PBS。除非另有說明，所有清洗步驟均為 3 分鐘，每次體積約 0.5 ml。免疫熒光和相差圖像使用 Lionheart FX 系統（Agilent BioTek）結合 Gen5 軟件（3.14）採集。每孔採集 16 張圖像，使用相差、DAPI、GFP 和 TexasRed 通道。圖像在 ImageJ 中處理。按通道加載圖像堆棧，並利用每種條件下的 DAPI 染色創建二值掩膜，以識別單個細胞核區域。
隨後，使用 DAPI 掩膜測量 GFP 和 TexasRed 通道中染色信號的強度。以此方式提取所有條件下每種染色每個細胞核的平均強度，並使用 ggplot2 [ 進行繪圖。
對於微圖案培養和終點免疫熒光染色，使用 Cytoo Arena A 微芯片（CYTOO，10-020-00-18）。將芯片置於已加入 3 ml 1x PBS 的 6 孔板中。隨後移除 1x PBS，加入 3 ml 4 ug/ml 的 Laminin（溶於 1x PBS），並置於細胞培養箱中於 37°C、5% CO2 條件下孵育 2 小時。每孔加入 6 ml 1x PBS 後再移除 6 ml 溶液以進行清洗，重複 5 次。
然後每次處理一個孔，移除全部溶液，加入 3 ml 2i+Lif 培養基 + 10uM ROCK 抑制劑（Stemcell Technologies，72304）。平板置於培養箱中，待當天需要時使用。接種細胞時，分別收集 sgCtrl-mESCs、sgGata6-mESCs 和 sgCdx2-mESCs，計數後按 1:1:1 比例混合。隨後每孔加入 120,000 個細胞（每個細胞系 40,000 個）。
2 小時後，將培養基更換為標準分化培養基：DMEM+Glutamax、15% ESC 級 FBS、1x 丙酮酸鈉、1x 非必需氨基酸、1x Pen/Strep 和 0.1 mM β-巰基乙醇，並在處理組孔中加入強力黴素。培養基每日更換，每次處理一個孔。細胞在微芯片上培養 72 小時後進行免疫熒光染色。
為進行免疫染色，首先去除 Cytoo Arena A 微芯片中的培養基，並用 1× PBS 清洗孔一次；隨後每孔加入 3 ml 溶於 1× PBS 的 3.6% 甲醛，並在室溫下孵育 30 分鐘。每孔用 1× PBS 清洗兩次後，將微芯片從 6 孔板轉移至單獨的 35 mm 培養皿中，每個微芯片對應一個培養皿，且其中預先加入 3 ml 1× PBS。隨後以 3 ml 溶於 1× PBS 的 0.2% Triton 溶液替換原溶液，並在室溫下孵育 30 分鐘。
每個培養皿用 1× PBS 清洗一次後，加入 3 ml 封閉液，在室溫下孵育 2 小時；封閉液組成為 1× PBS 中含 3% BSA 和 0.1% Triton。去除封閉液後，每皿加入 2.5 ml 一抗孵育液，其組成為 1× PBS 中含 1% BSA，並按下表所示加入稀釋後的一抗。培養皿於 4°C 過夜孵育。
次日，去除一抗孵育液後，培養皿用 1× PBS 中含 0.1% Tween 的溶液清洗兩次，再用 1× PBS 清洗一次。隨後每皿加入 2.5 ml 二抗孵育液，並在室溫下孵育 2 小時；二抗孵育液組成為 1× PBS 中含 1% BSA，並按下表所示加入稀釋後的抗體。去除二抗孵育液後，培養皿加入 0.5 ug/ml DAPI 和 1× PBS 中含 0.1% Tween 的溶液，孵育 10 分鐘。
隨後培養皿用 1× PBS 中含 0.1% Tween 的溶液清洗一次，再用 1× PBS 清洗兩次。成像前，每皿加入 3 ml 1× PBS。除非另有說明，所有清洗步驟均持續 5 分鐘，體積均為 1 ml。免疫熒光圖像採用 Zeiss LSM<880 共聚焦激光掃描顯微鏡系統採集。
對於每個通道，首先對平鋪採集的圖像掃描進行拼接，隨後在 Zeiss ZEN 軟件中對 z 堆棧（11 層圖像堆棧，z 軸間隔為 3.19 μm）進行最大強度投影。所得圖像按通道導入 Napari，並使用 StarDist（stardist-napari 2022.12.6）進行分割。所採用的設置如下：模型類型：2D。預訓練模型：Versatile（熒光細胞核）。圖像歸一化：是，百分位下限 = 1.00，百分位上限 = 99.80。概率/評分閾值：0.6。重疊閾值：0.5。輸出類型：僅標籤。
歸一化軸：ZYX。時間序列標籤：與前一幀匹配（基於重疊）。使用每個區域的方形形狀圖層提取並裁剪各個獨立區域。對於每個通道，採用 RegionProps（napari-skimage-regionprops 0.10.1）對分割數據進行分析，以提取每個單獨分割細胞的位置、大小及信號強度，並導出為數據表。使用 ggplot2 繪製各區域細胞的數量和比例。採用 ggplot2 的 geom_bin2d 選項並設置 15 個分箱繪製密度圖。
對於每個區域，基於質心數據，將 x/y 座標縮放至 0–1 範圍，其中 0 表示沿 x/y 軸第一個細胞所在的最小像素位置，1 表示最後一個細胞所在的最大位置，以校正尺寸和裁剪上的微小差異，從而更好地捕捉平均模式。
對於不同共培養 mESC 細胞系的活細胞成像與追蹤，對 pSLQ1371 sgRNA 質粒進行了修飾，將其中的 mCherry 替換為 Clover 或 mTagBFP。另在每種熒光蛋白的 C 端添加了 Myc 核定位信號（NLS）（即 mCherry-NLS、Clover-NLS 和 mTagBFP-NLS）。
如前所述，通過慢病毒轉導將分別編碼 sgCtrl-mTagBFP-NLS、sgGata6-mCherry-NLS 或 sgCtrl-Clover-NLS 的 DNA 導入穩定整合誘導型 dCas9-VPR 的 mESC 細胞系。
對於活細胞微圖案培養，使用了 RosetteArray™（Neurosetta，Spinal 6-Well 100µm RosetteArray™ Plate）六孔板，其生長區域為 100 µm。各孔先用 1× PBS 清洗一次，隨後加入 3 ml、濃度為 4 µg/ml 的 Laminin（溶於 1× PBS），並在細胞培養箱中於 37°C、5% CO2 條件下孵育 6 小時。隨後每次處理一個孔，每孔用 3 ml 1× PBS 清洗一次。
接着，同樣每次處理一個孔，移除全部溶液並加入 2 ml 標準分化培養基。培養板隨後置於培養箱中，待當天使用。分別收集 sgCtrl-mTagBFP-NLS-mESCs、sgGata6-mCherry-NLS-mESCs 和 sgCdx2-Clover-NLS-mESCs，進行計數後按 1:1:1 的比例混合。隨後每孔加入 400,000 個細胞（每個細胞系 133,000 個），加入體積為 1 ml，使每孔總體積達到 3 ml。6 小時後，向處理孔中加入強力黴素。
培養基每日更換一次，每次處理一個孔。進行活細胞成像時，將培養板置於配備濕度腔、溫度（37°C）和 CO2（5%）控制的 Lionheart FX 成像儀中。使用相差、YFP 和 TexasRed 通道，每小時成像一次，總計 48 小時。
由 Lionheart FX 獲得的拼接圖像使用 Gen5 3.14 軟件進行拼接。將延時成像數據作為圖像堆棧導入 imageJ，對單個微圖案區域進行裁剪，並按通道保存為獨立的圖像序列。對於每個微圖案區域，將延時成像數據作為堆棧導入 Napari。使用 StarDist 並啟用隨時間標記選項對細胞進行分割。隨後，使用 Btrack 插件（0.6.4）對延時成像數據中的單個細胞進行追蹤，並導出為 h5 文件。
採用 Btrack 預設的“cell”設置，但將 Motion Accuracy 提高至 10。對於活細胞數據影片，在 Napari 中對各圖層進行排列和/或疊加，並使用 wizard 插件（napari-animation 0.0.7）導出。對於細胞動態的詳細分析，從 h5 文件中提取細胞位移數據並導出為 .csv 文件格式，隨後使用 CelltrackR（1.1.0）進行進一步處理。
為了在三維結構中培養並分化 mESC，將細胞接種於 24 孔 AggreWell 400 板（Stemcell Technologies，34415）中。每孔先用 1× PBS 清洗一次，隨後加入 0.5 ml 抗黏附溶液（Stemcell Technologies，07010）。將培養板以 1,000 rcf 離心 5 分鐘，並在室溫下孵育 20 分鐘。去除抗黏附溶液後，每孔加入 1 ml 1× PBS。在接種細胞前，將培養板保持於室溫。
接種前即刻去除 1× PBS，並加入 1 ml 標準分化培養基 + 20 uM ROCK 抑制劑。對於處理孔，加入 1 ug/ml 多西環素。分別收集、計數並將 sgCtrl-mESC、sgGata6-mESC 和 sgCdx2-mESC 按 1:1:3 的比例混合。
隨後，每孔加入 32,000 個細胞（6,000 個 sgCtrl、6,000 個 sgGata6 和 20,000 個 sgCdx2），總體積為 1 ml，使每孔總體積達到 2 ml，且 ROCKi 的終濃度為 10 uM，多西環素的終濃度為 0.5 ug/ml。24 小時後，每孔更換 1.4 ml 培養基，使用不含 ROCKi 的標準分化培養基，並重復一次。再經過 24 小時後，每孔再次更換 1.4 ml 培養基。在處理條件下，每次換液時均加入多西環素。
對於細胞比例發生改變的條件，則相應調整細胞數量。
培養72小時後，製備CMEMs用於免疫染色。每孔移除1.5 ml培養基，並加入1.5 ml 1x PBS。將CPEMs靜置沉降1分鐘，然後每孔移除1.5 ml該溶液。每孔加入0.5 ml 1x PBS。通過輕敲培養板和/或上下吹打，使用剪口P1000槍頭以防止剪切損傷，使CPEMs重懸，隨後轉移至預先加入2 ml 1x PBS的6孔板中。每孔加入一個40 um細胞濾網（Corning，087711），並剪去側邊標籤，使其形成屏障，以防從孔中吸取溶液時將CPEMs一併吸走。
吸取溶液時，將培養板輕微傾斜，使約0.5至1 ml溶液保留在孔中，以保持CPEMs處於懸浮狀態。隨後以此方式移除1x PBS，並用2 ml 1x PBS中的3.6%甲醛洗滌每孔，之後每孔加入2 ml 1x PBS中的3.6%甲醛，並於室溫下置於軌道搖床上孵育40分鐘。孵育期間，移除細胞濾網以改善CPEMs與緩衝液的混勻。洗滌過程中，短暫移除細胞濾網，並在每次加入洗液後重新插入，以促進溶液混勻。
吸去甲醛溶液後，先用1次1x PBS + 0.01% Tween + 1x Glycine（Cell Signaling Technology，#7005）洗滌，再用1x PBS + 0.01% Tween洗滌2次。各孔再用1次1x PBS + 0.2% Triton-X100洗滌，隨後加入2 ml 1x PBS + 0.2% Triton X-100，並於室溫下置於軌道搖床上孵育30分鐘。
移除溶液後，用封閉緩衝液（1x PBS + 3% BSA + 0.1% Triton-X100）洗滌1次，隨後加入2 ml封閉緩衝液，並於室溫下置於軌道搖床上孵育2小時。移除溶液後，用抗體孵育緩衝液（1x PBS + 3% BSA）洗滌1次，隨後每皿加入2 ml一抗孵育液，其中包含按下表稀釋的抗體。培養皿於4°C下置於軌道搖床上過夜孵育。
移除一抗溶液後，各孔用1x PBS + 0.1% Tween洗滌3次。各孔再用抗體孵育緩衝液（1x PBS + 3% BSA）洗滌1次，隨後每皿加入2 ml二抗孵育液，其中包含按下表稀釋的抗體。培養皿於4°C下置於軌道搖床上過夜孵育。
移除二抗溶液後，各孔用1x PBS + 0.1% Tween洗滌2次。每孔加入2 ml DAPI孵育液，其組成為1x PBS + 0.01% Tween + 2 ug/ml DAPI，並於室溫下置於軌道搖床上孵育10分鐘。各孔再用1x PBS洗滌2次，隨後加入2 ml 1x PBS + 0.1 sodium azide保存。
為進行成像，將 CPEM 轉移至玻璃底 8 孔腔室載玻片（Ibidi，80827）中。向 8 孔腔室載玻片的每個孔中加入 250 ul 的 1x PBS + 90% 甘油（Millipore Sigma，G2025）+ 0.1% 疊氮化鈉。緩慢旋轉裝有 CPEM 的 6 孔板，使 CPEM 聚集於中央，然後吸取 50 ul 加入 8 孔腔室載玻片的孔中。蓋上 8 孔腔室載玻片蓋，並用透明指甲油（Ted Pella，114-7）封口。載玻片於 4°C 過夜保存，使 CPEM 在成像前沉降。
使用 Zeiss 880 共聚焦顯微鏡對 CPEM 進行成像，採用 20x 長工作距離物鏡。為進行 z 軸方向的光學切片，圖像以每 3.89 um 的間隔採集一次。
將圖像堆棧導入 imageJ，並從每個圖像堆棧中裁剪出單個 CPEM，按通道分別保存為獨立的圖像序列。將每個 CPEM 的各通道圖像序列導入 Napari，並使用 StarDist（stardist-napari 2022.12.6）進行分割。採用以下設置：模型類型：2D。預訓練模型：Versatile（熒光細胞核）。圖像歸一化：是，percentile low = 1.00，percentile high = 99.80。概率/評分閾值：0.6。重疊閾值：0.5。輸出類型：僅標籤。
歸一化軸：ZYX。時間序列標籤：與前一幀匹配（通過重疊）。分割標籤層中屬於其他 CPEM 的殘餘部分被刪除，因此僅分析單個完整 CPEM 的數據。對於每個通道，使用 RegionProps（napari-skimage-regionprops 0.10.1）對分割數據進行分析，以提取每個獨立分割細胞的位置、大小和信號強度，並導出為數據表。採用以下參數對數據進行篩選：平均強度 >400（Pou5f1）和 >200（Cdx2、Foxa1）的細胞核納入後續分析。
面積 >400 且 <16000 的細胞核納入後續分析。使用 ggplot2 繪製各區域的細胞數量及其比例。採用 ggplot2 的 geom_bin2d 選項繪製密度圖，使用 9 個分箱。對於每個區域，基於質心數據，將 x/y 座標縮放至 0–1，其中 0 表示沿 x/y 軸檢測到第一個細胞時的最小像素位置，1 表示沿 x/y 軸檢測到最後一個細胞時的最大位置。在 z 軸方向，基於質心數據，將 z 位置歸一化到每個樣本中首次檢測到細胞的圖像。
這校正了 CPEM 數據大小和裁剪範圍的微小差異，以及採集過程中其在成像緩衝液中的位置差異，從而更好地捕捉平均模式。腔體分析在 imageJ 中完成。
CPEM按照先前描述的方法培養72小時。每孔移除1.5 ml培養基，並加入1.5 ml 1× PBS。隨後移除其中1.5 ml該溶液，並向每孔加入0.5 ml 1× PBS，使用剪口移液槍頭將CPEM轉移至微量離心管中。離心管以300 rcf離心5分鐘。去除上清液後，將CPEM輕柔重懸於1 ml DMEM/F12（Thermo Fisher，11039021）中，隨後再次以300 rcf離心5分鐘。去除上清液後，將CPEM重懸於1 ml Trypsin-EDTA中。
在37°C孵育5分鐘前，將CPEM上下吹打3次。隨後將CPEM上下吹打6次，並向每管中加入200 ul ESC級合格FBS，之後以300 rcf離心5分鐘。去除上清液後，將細胞重懸於0.5 ml標準分化培養基中並轉移至凍存管。取樣測定細胞活力，活力>80%的樣本用於後續應用。向每個凍存管中加入0.5 ml 2×凍存液，所述凍存液由85% ESC級合格FBS / 15% DMSO組成，並輕柔混勻。
將凍存管置於細胞凍存盒中，於−80°C過夜孵育，隨後在液氮（氣相）細胞儲存系統中保存，直至進行單細胞RNA測序製備。每個凍存管約凍存100萬個細胞。每個樣本均從同一批次CPEM中額外凍存一管。該額外凍存管在進行單細胞RNA測序製備前被複蘇，並再次評估細胞活力。
凍存管被送至美國聖何塞Novogene公司進行處理，在該處按照10X Genomics v3單細胞3’ RNA-seq文庫製備方案進行樣本製備。共製備4個樣本，每個樣本捕獲5,000個細胞，並進行平行測序（NovaSeq 6000），每個樣本的雙端測序輸出為200M reads，最終每個樣本中每個細胞約獲得40,000個雙端reads。
Fastq文件使用kallisto-bustools進行比對，基因計數和條形碼數據亦採用該工具進行處理[
所得輸出矩陣經過過濾並轉換為seurat文件（Seurat 5.0.1）[
所獲得的seurat文件用於生成所示的umap圖、featureplot和dotplot。混合細胞CPEM樣本的seurat文件還用於使用CellChat（2.1.1）進行配體-受體相互作用分析，代碼如下：
單細胞RNA測序分析的原始數據、計數矩陣、seurat文件和CellChat文件可在GEO數據庫中取得，登入號為GSE256138。
S.A、G.A.L 和 S.K 構思了該項目，開展了實驗並分析了大部分結果。S.A 和 G.A.L 撰寫了論文並製作了圖表。C.H 進行了免疫染色並分析了 3D 胚胎模型的共聚焦圖像。A.Z 和 S.L 參與了活細胞成像 2D 微圖案實驗的分析。L.S.Q. 對論文和 CRISPR 資源提供了反饋。G.K 和 R.A 製備了用於活細胞成像實驗的微圖案培養皿。B.R.T 建立了使用 2D 微圖案培養的初始實驗並審閱了論文。
本研究獲得了 NIGMS/NIH Pathway to Independence Award K99GM126027/R00GM126027、Maximizing Investigator Award（R35GM147395）以及加利福尼亞大學聖克魯茲分校提供的啟動經費包（S.A.S）的資助。G.A.L. 獲得了荷蘭研究理事會（NWO）Rubicon 獎學金的資助。
B.T 獲得了美國國立衛生研究院（NIH，資助編號 K12GM139185）以及加州大學聖克魯茲分校幹細胞生物學研究所（IBSC）的資助。G.K 和 R.A 獲得了 NIH/NIEHS FastTrack STTR Award（R42ES033912）的資助。本文內容完全由作者負責，並不一定代表 NIH 或 IBSC 的官方觀點。技術支援由加州大學聖克魯茲分校生命科學顯微中心 Benjamin Abrams 提供，RRID：SCR_021135。
G.K 和 R.A 是 Neurosetta 的聯合創始人，該公司專注於 RosetteArray 平台的商業化。
我們感謝 Camilla Forsberg 博士、Russ Corbett-Detig 博士和 Euiseok Kim 博士對我們論文提出的反饋意見。我們還要感謝 Shariati 實驗室的成員，尤其感謝 Dr. 對論文提出的反饋。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.05.583597
🏷️ 胚胎幹細胞 表觀基因組編輯 CRISPR啟用 自組織 胚胎模型