能夠高效生成滋養層和上胚層兩種譜系的幹細胞的缺乏，阻礙了對胚胎發育過程的精準重現。通過高內涵化學篩選，我們建立了一種AL培養基，用於生成小鼠和人雙向多能幹細胞（bidirectional pluripotent stem cells, BPSCs），其特徵為同時表達OCT4/CDX2。小鼠BPSCs在體外48小時內無需外源誘導因子即可高可塑性地分化為滋養層、上胚層和原始內胚層譜系，並且在體內能夠高效貢獻於胚胎及胚外組織。
從機制上看，Wnt信號通路的高啟用通過啟動一種依賴Lef1的旁路，打破了早期譜系分化屏障。值得注意的是，BPSCs能夠高效生成E8.5類胚體，完成原腸胚形成，並表現出腦發育、封閉的神經管、搏動的心臟、體節形成以及原始生殖細胞等高級特徵。這些發現凸顯了BPSCs作為研究早期譜系決定和原腸胚形成後胚胎發育的有力工具的價值，並在多物種中的應用具有潛力。
哺乳動物胚胎經歷兩次關鍵的細胞命運決定，從而形成著床前的三種譜系：滋養外胚層（TE）、上胚層（Epi）和原始內胚層（PrE）。
由於譜系屏障的建立，ESC向TSC的轉化通常需要強制表達外源轉錄因子（CDX2）。
構建類胚胎結構是一種通過多種細胞系的三維共培養來重現胚胎發育過程的方法。目前，通過多種細胞的共培養，已經可以獲得胚泡樣體（blastoids，囊胚樣結構）、原腸胚形成類胚胎結構（胚胎第6.5天樣結構，E6.5-like structure）以及原腸胚形成後的合成胚胎（E8.5-like structure）。
在本研究中，通過高內涵篩選，我們鑑定出一種細胞培養條件，能夠便捷且無損地使小鼠和人多能幹細胞同時表達兩者。
為了篩選促進多能幹細胞向滋養層譜系細胞分化的培養條件，我們首先建立了擴展多能幹細胞（EPSC）系，其具有
（A）LY處理細胞的濃度測試。代表性形態學圖像和
（B）AS處理細胞的濃度測試。代表性形態學圖像和
（C）小提琴圖顯示代表性基因表達（
（D）桑椹胚（16細胞期，上）、E3.5囊胚（中）和E4.5囊胚（下）的免疫熒光染色。CDX2和OCT4染色。比例尺，20 μm。
（E）EBPSC（於AL培養基中由桑椹胚衍生）的核型分析。
（F）E12.5日四倍體補償胚胎及生殖嵴的明場圖像。△PE-
（A）用於……的化學文庫篩選示意圖
(B) 維恩圖顯示，與陰性對照相比，261種小分子可顯著提高GFP表達，10種可顯著提高mCherry表達。兩組共同的小分子為LY2090314和AS1842856。
(C) 代表性FACS分析，顯示……的百分比
(D) 代表性形態學圖像及
(E) EPSC和EPSC-AL-D3的免疫熒光染色。檢測CDX2和OCT4。比例尺，20 μm。
(F) EPSC、TSC和EPSC-AL-D2中核蛋白OCT4和CDX2的代表性FACS分析。
(G) 代表性形態學圖像及
(H) 代表性FACS分析，顯示……的百分比
(I) E18.5天四倍體補償胚胎及成年小鼠的明場圖像。
(J) 示意圖（左圖）顯示BPSC流式分選及傳代培養兩個代次。代表性FACS分析顯示Oct4-GFP陽性和CDX2-mCherry陽性細胞的百分比（右圖）。
在首次細胞命運決定之前，小鼠胚胎也表現出關鍵轉錄因子的共表達
接下來，我們考察了BPSC是否能夠在體外長期維持。培養和熒光啟用細胞分選（FACS）分析顯示，BPSC在超過10代傳代過程中仍可保留高達41.58%的CDX2和OCT4雙陽性細胞，並維持圓頂狀克隆形態（
為了探究CDX2和OCT4雙陽性細胞組成比例的穩定性，我們從BPSC中流式分選出單陽性（Oct4+/Cdx2-）和雙陽性（Oct4+/Cdx2+）細胞亞群，並分別在AL培養基中維持培養（P0）。值得注意的是，到第1代（P1）時，這兩個亞群均重新建立了雙陽性細胞的原始平衡（
先前研究表明，小鼠多能幹細胞或類全能幹細胞若無滋養外胚層（TE）核心轉錄因子CDX2的外源表達，無法快速轉化為TSC
(A) BPSC（來源於EPSC）、ESC和EPSC在無誘導因子條件下自發分化2天的示意圖。
(B) BPSC（來源於EPSC）、ESC和EPSC在無誘導因子條件下自發分化兩天後的典型明場圖像。
(C) BPSC（來源於EPSC）、ESC和EPSC自發分化2天后的免疫熒光染色。檢測OCT4、CDX2和GATA6。比例尺，50 μm。
(D) BPSC（來源於EPSC）、ESC和EPSC自發分化2天后的代表性FACS分析。
(E) 來自E4.5胚胎細胞、BPSC（來源於EPSC）自發分化1天或2天后，以及EPSC自發分化2天后的scRNA-seq數據的UMAP圖。細胞根據其細胞類型着色，並按其來源分組顯示。
(F) 採用TSM誘導BPSC分化2–3天的示意圖。誘導3天后，通過FACS分選收集CDX2-mCherry陽性或CDCP1陽性細胞，並繼續使用TSM進行培養。誘導2天后，將細胞注射到8細胞期胚胎中進行嵌合實驗。
(G) 對BPSC-TSC（來源於EPSC）、BPSC-TSC（來源於ESC）以及TSC（來源於胚胎）進行免疫熒光染色。檢測SOX2和TFAP2C。比例尺，20 μm。
(H) 採用上述方法制備的E6.5嵌合胚胎的免疫熒光染色（
(I) E12.5時期嵌合胎盤的免疫熒光染色。檢測TPBPA和GFP。比例尺，500 μm。
為探究其發育狀態，我們對BPSC和EPSC自主分化細胞的scRNA-seq數據進行了UMAP分析（
(A) E4.5胚胎細胞、BPSC（來源於EPSC）自發分化1天或2天后，以及EPSC自發分化2天后的上胚層（Epi）譜系、滋養外胚層（TE）譜系和原始內胚層（PrE）譜系代表性基因表達。
(B) 採用流式細胞術分選單陽性和雙陽性細胞，並排除PDFFRA陽性細胞。
(C) 自發分化2天后Oct4+/Cdx2+和Oct4+/Cdx2−細胞的免疫熒光染色。檢測OCT4、CDX2和GATA6。比例尺，20 μm。
(D) 在有或無FGF4和肝素條件下分化細胞的免疫熒光染色。檢測OCT4、CDX2和GATA6。比例尺，20 μm。
(E) 堆疊柱狀圖顯示在有或無FGF4和肝素條件下Oct4+/Cdx2+和Oct4+/Cdx2−細胞分化的百分比。
由於BPSC由單陽性（
為確定是否能夠建立TSC細胞系，採用定向誘導培養基（含Fgf4和肝素的TSM）處理BPSC 3天，並使用CDX2-mCherry或CDCP1（TSC的表面標誌物）進行檢測（
(A) EPSC、ESC、TSC、BPSC(EPSC)-TSMD3（來源於EPSC的BPSC經TSM誘導3天）和BPSC(ESC)-TSMD3（來源於ESC的BPSC經TSM誘導3天）中CDCP1陽性細胞比例的代表性FACS分析
(B) 對BPSC-TSC（EPSC）、BPSC-TSC（ESC）和TSC（來源於胚胎）進行免疫熒光染色。檢測SOX2和CDX2。比例尺，20 μm。
(C) 採用上述方法制備的E6.5嵌合胚胎的代表性形態學圖像（
(D) 經TSM誘導2天分化的BPSC與ESC的E6.5嵌合胚胎形成率。
(E) E12.5時期ESC和BPSC-diff-D2嵌合體的代表性圖像。
為探究BPSC的分化潛能
這些結果表明，BPSC在胚內和胚外譜系發育的雙向分化潛能方面具有非凡的可塑性。
為探究BPSC的組成，我們收集了scRNA-seq數據，並結合EPSC和ESC進行了統一流形近似與投影（UMAP）分析（
(B) 柱狀圖顯示了在 BPSC、EPSC 和 ESC 中，從 scATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq、H3K27me3 ChIP-seq 和 H3K4me3 ChIP-seq 數據中鑑定出的峰數量。
(C) 堆疊柱狀圖顯示了在 BPSC、EPSC 和 ESC 中，從 scATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq、H3K27me3 ChIP-seq 和 H3K4me3 ChIP-seq 數據中鑑定出的峰在基因組上的分佈。
(D) 堆疊柱狀圖顯示了在 BPSC 與 ESC 或 BPSC 與 EPSC 之間鑑定出的上調和下調差異可及性峰的數量。
(E) 基因組瀏覽器視圖顯示了 H3K27ac、H3K27me3 和 H3K4me3 組蛋白修飾在……上的分佈。
(F) 餅圖顯示了根據……的表達狀態進行分組的 BPSC 的分佈。
(H) BPSC、EPSC、ESC 以及植入前小鼠胚胎從合子到 E4.5 囊胚階段的上胚層（Epi）譜系、滋養外胚層（TE）譜系和原始內胚層（PrE）譜系的代表性基因表達。
(A) BPSC、EPSC 和 ESC 的 scRNA-seq 數據的 UMAP 圖。
(C) 熱圖顯示了 BPSC、EPSC 和 ESC 中 TE 和 ICM 標誌基因的表達。基因表達經 TPM 標準化並進行對數轉換。在 BPSC 與 ESC 或 EPSC 比較中鑑定為差異表達基因（DEG）或無顯著差異基因（NS）的基因，其代表性基因顯示在熱圖左側。
(D) 以 TE 和 ICM 標誌基因啟動子區域中的峰（±1 kb）為中心的染色質可及性信號熱圖，展示了 BPSC、EPSC 和 ESC 中的信號分佈。每一行對應一個單獨的峰，顏色刻度表示歸一化後的可及性信號。熱圖上方的折線圖顯示了峰周圍的平均可及性分佈特徵。
(E) 基因組瀏覽器視圖顯示了代表性 TE 和 ICM 標誌基因區域上的染色質可及性信號分佈。紅色虛線表示 BPSC 與 EPSC/ESC 之間的差異染色質可及性信號。
(F) 基於 BPSC、EPSC 和 ESC 的 scATAC-seq 數據進行的轉錄因子足跡分析。圖中顯示了以若干轉錄因子基序（±250 bp）為中心的歸一化 Tn5 插入頻率。不同曲線代表不同細胞類型。
(G) 散點圖顯示了……之間的表達水平。
(H) BPSC、EPSC 和 ESC 以及植入前小鼠胚胎從合子到 E4.5 囊胚階段的 scRNA-seq 數據的 UMAP 圖。
(I) BPSC、EPSC、ESC 以及植入前小鼠胚胎從合子到 E4.5 囊胚階段的層次聚類分析。
與 FACS 和免疫熒光染色結果相似，單細胞轉錄組分析顯示，約 48% 的細胞共表達……
為了將 BPSC 與植入前胚胎進行比較，我們結合已發表的植入前胚胎數據分析了單細胞 RNA-seq 數據。UMAP 顯示，BPSC 與桑椹胚階段（16 細胞期）的胚胎相似，而該階段標誌着第一次細胞命運決定時期的開始。
為探究AL培養基賦予胚外分化能力的機制，轉錄組分析顯示，在AS、LY或聯合處理後，Wnt通路組分顯著上調（
(A) ESC、EPSC以及經LY或CHIR處理2天的ESC或EPSC的bulk RNA-seq數據主成分分析（PCA）。
(B) 顯示錶達水平的柱狀圖
(C) 在敲低對照和敲低條件下，經AS或LY處理的EPSC中Oct4-GFP陽性和CDX2-mCherry陽性細胞比例的代表性FACS分析
(D) 在敲低對照和Lef1敲低條件下，經AS或LY處理的EPSC的免疫熒光染色。CDX2染色。比例尺，20 μm。
(E) 野生型（WT）和Lef1敲除及敲低桑椹胚與E3.5胚胎的明場圖像。
(F) 野生型（WT）和Lef1敲除及敲低胚胎的囊胚形成率。
(G) 野生型（WT）和Lef1敲除及敲低E3.5胚胎的免疫熒光染色。CDX2和SOX2染色。比例尺，20 μm。
(H) 野生型（WT）和Lef1敲除及敲低E3.5胚胎中CDX2和SOX2熒光強度的統計分析。
(I) 熱圖顯示正常囊胚和的bulk RNA-seq中TE及多能性基因的表達
(A) 火山圖顯示經AS、LY或AS+LY（AL）處理的EPSC與未經處理EPSC之間的差異表達基因（左 panel），以及上調基因的GO富集分析（右 panel）。
(B) EPSC（LCDM）、AS、AS+2.5 μM IWR1、AS+15 μM IWR1、LY、LY+2.5 μM IWR1、LY+15 μM IWR1中Oct4-GFP陽性和CDX2-mCherry陽性細胞比例的代表性FACS分析。
(D) 基於BPSC相較於EPSC或ESC中上調的scATAC-seq峰進行基序分析所鑑定的前5個富集轉錄因子。
(E) 的轉錄因子足跡分析
(F) 在敲低對照和敲低條件下，BPSC（AL）中Oct4-GFP陽性和CDX2-mCherry陽性細胞比例的代表性FACS分析
(G) 柱狀圖顯示的bulk RNA-seq數據中若干TE標誌基因的表達
(H) 在敲低對照和Lef1敲低條件下，BPSC（AL）的免疫熒光染色。CDX2染色。比例尺，20 μm。
為進一步闡明Wnt信號通路的作用，我們在含有AS和LY的N2B27基礎培養基中加入了Wnt抑制劑IWR1。流式細胞術和轉錄組分析表明，即使低濃度IWR1也能顯著抑制AS和LY誘導的CDX2啟用，而OCT4表達基本不受影響（
為鑑定負責打破胚外譜系發育邊界的下游效應因子，我們分析了來自BPSC、EPSC和ESC的scATAC-seq數據。基序富集分析顯示，LEF1和TCF3作為Wnt通路的關鍵效應因子，是BPSC相較於EPSC或ESC在可及性上調區域中最顯著富集的轉錄因子（
在AL條件下敲低LEF1顯著降低了雙陽性細胞的比例，並下調了TE譜系基因的表達；轉錄組學分析以及顯示CDX2蛋白水平下降的免疫熒光結果進一步證實了這一點（
鑑於LEF1在雙能性中的關鍵作用，我們隨後考察了其對胚胎中首次細胞命運決定的影響。敲除和敲低
在證實BPSC能夠高效分化為胚胎及胚外譜系之後，我們進一步探索了其在模擬早期器官發生中的應用價值。值得注意的是，BPSC單獨即可形成類囊胚結構（
（C）類囊胚的免疫熒光染色。檢測CDX2和OCT4。比例尺，20 μm。
（D）利用BPSC構建胚樣結構（embryoid）的示意圖。
（E）採用IVC培養基培養4天所構建胚樣結構的代表性形態學圖像及免疫熒光染色。檢測GATA6、OCT4和CDX2。比例尺，100 μm和50 μm。
（F）採用IVC培養基培養5天所構建胚樣結構的代表性形態學圖像及免疫熒光染色。檢測TFAP2C、OCT4和SOX17。比例尺，100 μm和50 μm。
（G）來源於BPSC的第5天胚樣結構（右圖）與天然E3.5–E6.5胚胎（左圖）的UMAP圖。
（H）點圖顯示胚樣結構與天然胚胎中譜系特異性標誌物的代表性基因表達。
（I）E6.5–7.5樣胚樣結構的代表性形態學圖像。比例尺，100 μm。
（J）E7.5樣胚樣結構的免疫熒光染色。檢測OCT4和T。比例尺，100 μm。
（K）天然E7.5胚胎（上圖）與來源於BPSC的E7.5樣胚樣結構（下圖）的UMAP圖。
隨後，使用該方法培養了E5.5樣胚樣結構
因此，我們調整了方法：對於起始細胞（EPSC或ESC），一部分先轉化為BPSC，再分化為TE樣細胞和Epi樣細胞；另一部分則直接誘導為PrE樣細胞（
（A）的百分比的代表性FACS分析
（B）EPSC及經PrE誘導培養基處理1天的EPSC的免疫熒光染色。檢測GATA6、SOX17和OCT4。比例尺，20 μm。
（C）胚樣結構自第4天至第8天發育的明場圖像。
（D）正常發育胚樣結構效率的計算結果。發育良好的胚樣結構相對於第4天總聚集體的效率。誤差線表示標準誤（SE）。
（E）堆疊柱狀圖顯示天然E8.5–E9.0胚胎及來源於BPSC的胚樣結構中胚體各類細胞的百分比。
（F）天然E8.5–E9.0胚胎及來源於BPSC的胚樣結構中腦相關細胞的UMAP圖，按發育階段着色（左圖）或按細胞類型着色（右圖）。
（G）天然E8.5–E9.0胚胎及來源於BPSC的胚樣結構中心臟相關細胞的UMAP圖，按發育階段着色（左圖）或按細胞類型着色（右圖）。
(I) 箱線圖顯示了天然 E8.5-E9.0 胚胎和由 BPSC 衍生的胚樣體中 PGC 的 PGC 標誌基因表達水平。中心線表示中位數，箱體邊界表示四分位距。
(A) 利用 BPSC 構建胚樣體的示意圖。
(B) 胚樣體從第 4 天發育至第 8 天的明場圖像。
(C) 第 7 天胚樣體、第 8 天胚樣體以及天然 E8.75 胚胎的明場圖像。天然 E8.75 胚胎來源於在 EUCM 中培養 1.5 天的 E7.5 胚胎。
(D) 天然 E8.5-E9.0 胚胎與由 BPSC 衍生的第 8 天胚樣體的 UMAP 圖，按發育階段着色。
(E) 天然 E8.5-E9.0 胚胎（左圖）和由 BPSC 衍生的第 8 天胚樣體（右圖）的 UMAP 圖。
(F) 天然 E8.75 胚胎和第 8 天胚樣體的免疫熒光染色。SOX1 和 T 染色。比例尺，200 μm。白色虛線框表示尾芽，白色箭頭表示脊索。
(G) 天然 E8.75 胚胎和第 8 天胚樣體的免疫熒光染色。SOX1 和 MHC 染色。比例尺，200 μm。
(H) 天然 E8.75 胚胎和第 8 天胚樣體的免疫熒光染色。SOX2 和 HOXB4 染色。比例尺，200 μm。
P，後部；A，前部；EPC，胚外胎盤錐；Al，尿囊；Am，羊膜；BI，血島；Fg，前腸窩；H，心臟；NF，神經褶；NT，神經管；YS，卵黃囊。
為確定胚樣體中細胞譜系的完整性，我們進行了 scRNA-seq（
免疫熒光結果顯示，在第 8 天胚樣體中，頭部區域形成了神經褶，背部發育出神經管，並逐漸向尾部延伸。神經譜系標誌物 SOX1 和 SOX2 的表達水平呈現頭部高表達、尾部低表達的模式。從三維重建的組織結構圖像中可以清楚觀察到，靠近尾部的神經管已經閉合（
第 8 天胚樣體已表現出規律性的心臟搏動，對心肌標誌物肌球蛋白重鏈 II 的染色可清晰顯示位於胚樣體前部的早期心臟結構（
令人驚訝的是，使用帶有 ΔPE- 的細胞系
為進一步驗證 AL 化學組合在誘導人 BPSC 樣狀態方面的廣泛適用性，我們評估了其在 5i 培養條件下促進人幼稚型胚胎幹細胞（nESCs）雙向多能性方面的有效性（
(A) 人幼稚型胚胎幹細胞（nESCs）經 AL 處理 4 天后的誘導示意圖。
(B) 人 nESCs 經 AL 處理後的形態變化。比例尺，200 μm。
(C) 經 AL 處理的人 nESCs 中 OCT4 和 CDX2 表達信號的 FACS 分析。
(D) AL 處理組和 5i 條件下人 nESCs 的 OCT4 和 CDX2 免疫熒光染色。比例尺，50 μm。
(E) 第 4 天 AL 處理組和對照組（Ctrl）人 nESCs 的 UMAP 可視化圖。右側展示了 EPI 特異性基因（POU5F1、DPPA3）和 TE 特異性基因（CDX2、HAND1、KRT8 和 KRT18）的表達。
(F) 氣泡圖展示了AL處理組與對照組（Ctrl）人nESCs中EPI特異性基因和TE特異性基因的表達情況。
(G) AL處理nESCs與E3至E7階段天然囊胚單細胞轉錄組的整合UMAP圖，按發育階段着色。
(H) 包含AL處理nESCs與天然囊胚的整合單細胞轉錄組UMAP嵌入圖，按細胞譜系着色。
(I) 箱線圖顯示了AL處理人nESCs在不同naïve培養條件和遺傳背景下的CDX2表達。
(J) 火山圖鑑定了AL處理人nESCs中的差異表達基因。紅點表示上調基因，藍點表示下調基因。
(K) AL處理人nESCs的基因本體論（GO）術語網絡分析。
為闡明AL誘導雙能性的分子動態機制，我們對第4天的AL處理組和對照組人nESCs進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）（
為進一步驗證AL誘導人BPSC樣細胞的內在身份及譜系承諾，我們將其映射到人胚胎發育（E3-E7）的單細胞圖譜中，方法是與已發表的天然人植入前胚胎數據集進行整合。轉錄組分析顯示，AL處理細胞與胚胎第5至第6天最為接近，整合分析進一步證實這些細胞同時具有EPI和TE特徵（
(A) AL處理nESCs與天然囊胚中Epi譜系、TE譜系和PrE譜系的代表性基因表達。
值得注意的是，這種TE預備狀態具有一致性，並且不依賴於naïve培養條件或遺傳背景，這一點可由多種人nESC系（H9、H1、TJ-1#）中CDX2的穩定啟用得到證明（
在胚胎早期發育過程中，從16細胞期到早期囊胚階段可觀察到一過性的CDX2和OCT4雙陽性細胞群。
在本研究中，我們通過小分子篩選成功捕獲了小鼠和人CDX2與OCT4雙陽性細胞，並將其命名為BPSCs。這些細胞在基因表達方面與16細胞期胚胎更為相似，並且能夠貢獻於胚胎組織和胚外組織。
BPSCs的成功捕獲依賴於小分子LY和AS，它們分別作為GSK3和FOXO1的抑制劑發揮作用。已有研究報道，WNT通路可在小鼠和大鼠胚胎幹細胞中啟用CDX2表達。
BPSCs形成類胚結構，規避了發育研究中胚胎稀缺以及著床過程“黑箱”特性的限制，從而推動了發育生物學領域的發展。此前，類胚結構的構建需要複雜的細胞組合且效率較低。本研究表明，BPSCs可通過改變培養體系形成類似E5.5–E8.5階段的結構。
總之，我們通過聯合使用小分子 AS 和 LY，成功捕獲了一種獨特的雙向發育細胞狀態（BPSCs），該狀態不同於全能態和多能態。本研究為譜系發育及類胚結構的構建提供了一種有前景的方法。
S.G.、W.L.、Y.W. 構思了該項目並提供指導；K.L.、D.B 和 Y.B. 設計並完成了大部分實驗；Z.Y. 提供了生物資訊學支援；R.J 和 K.W. 進行了化合物文庫篩選；K.L.、D.B.、Z.Y. 撰寫了初稿；K.L.、D.B.、Z.Y.、W.L.、J.Y.、S.G. 負責論文的審閱與修改；J.X.、Y.S.、B.D.、X.M.、Z.N.、S.Y.、Y.L.、X.L.、Y.J.、Y.Z.、Y.Z、Y.L.、C.X.、S.L.、S.L.、J.C.、J.Y.、X.K.、Y.Z.、H.W. 協助完成實驗。
作者聲明不存在競爭性利益。
補充表 1. 小分子及其靶點
補充表 2. sgRNA 與 siRNA 序列
補充影片 1. 卵黃囊中的第 8 天類胚體，具有跳動的心臟
補充影片 2. 切開羊膜後具有跳動心臟的第 8 天類胚體
更多資訊以及資源和試劑取得請求應聯繫並將由通訊聯繫人 Shaorong Gao 負責提供（
本研究未產生新的獨特試劑。
本研究期間產生的 bulk RNA-seq、單細胞 RNA-seq 和單細胞 ATAC-seq 數據可在國家基因組數據中心的 Genome Sequence Archive 取得（
所有動物實驗均遵循實驗動物使用指南，並經同濟大學批准。所有動物均飼養和繁育於中國上海同濟大學特定病原體陰性（SPF）動物研究設施中。6–8 周齡的 C57BL/6、ICR、129 小鼠購自北京查爾斯河實驗動物有限公司（中國）。在所有器官中穩定表達熒光基因的 B6.Cg-Tg(CAG-GFP)Smoc 小鼠購自上海模式生物研究中心（中國）。攜帶 △PE- 的 TgOG2 小鼠
小鼠成纖維細胞經絲裂黴素（MMC；Sigma–Aldrich，M0503）處理後作為飼養層用於培養小鼠幹細胞，僅少數實驗採用無飼養層條件。所有小鼠幹細胞均在 37°C、5% CO₂ 的濕潤培養箱中培養。
ESC 培養基（ESM）為用於培養 ESC 的基礎培養基，成分包括 1 mM L-谷氨醯胺（Millipore，25030–081）、0.1 mM β-巰基乙醇（GIBCO，21985–023）、1× 非必需氨基酸（Millipore，TSM-001-C）、1× 青黴素-鏈黴素（Thermo Fisher，15140122）、1× 核苷（Millipore，ES-008-D），以及在 DMEM（Sigma–Aldrich，D5671）中加入 15%（v/v）胎牛血清（FBS）（HyClone，SH30070.03）。
在本研究中，ESC 在補充有 2i/LIF 的 ESM 中培養（1 mM MEK 抑制劑 PD0325901，Selleck，1036S；3 mM GSK-3 抑制劑 CHIR99021，Selleck，S2924；以及 10 ng ml
EPSC 在 EPSC 培養基中培養，該培養基已在已發表研究中描述。
BPSC 在 N2B27 基礎培養基中培養，並補充 10 nM LY2090314（MedChem Express，HY-16294）和 0.6 μM AS1842856（MedChem Express，HY-100596）。
TSC按照已發表研究中描述的方法，在TSC培養基（TSM）中培養。
PrE誘導培養基由N2B27基礎培養基組成，並補充2.5 μM 1-Azakenpaullone（Selleck Chemicals，S7193）、100 ng/mL重組人FGF4（PeproTech，100–31）、0.2 μM TTNPB（Selleck Chemicals，S4627）和1 mM 8Br-cAMP（Selleck，S7857）。
BPSC來源於桑椹胚（16至32細胞期），其取得自
初始態人PSC維持於5iLAF培養基中，該培養基由naïve基礎培養基組成，包含DMEM/F12:Neurobasal（1:1）（Thermo Fisher）、1% N2添加劑（Thermo Fisher）、2% B27添加劑（Thermo Fisher）、0.5% KnockOut SR（Thermo Fisher）、1%非必需氨基酸（Millipore）、2 mM GlutaMAX（Millipore）以及青黴素-鏈黴素（Millipore），並加入1 μM PD0325901（Selleck）、0.5 μM SB590885（Selleck）、1 μM WH-4-023（Selleck）、1 μM IM12（Selleck）、10 μM Y-27632（Selleck）、20 ng/ml activin A（PeproTech）、20 ng/ml人LIF（Millipore）、8 ng/ml bFGF（PeproTech）和50 μg/ml BSA（Sigma-Aldrich）。
4CL培養基由Neurobasal培養基（Gibco，21103049）與Advanced DMEM/F12（Gibco，12634028）按1:1混合組成，並補充1% N2（Gibco，17502048）、2% B27（Gibco，17504044）、1 mM丙酮酸鈉（Corning）、非必需氨基酸（Corning）、1 mM GlutaMAX（Gibco）、青黴素-鏈黴素（Millipore）、10 nM DZNep（Selleck）、5 nM TSA（Selleck）、1 μM PD0325901（Selleck）、5 μM IWR-1（Selleck）、20 ng/ml人LIF（Peprotech）、20 ng/ml activin A（Peprotech，120-14E）、50 μg/ml L-抗壞血酸（Sigma）以及0.2%（v/v）Matrigel。
初始態細胞每4–7天使用Accutase（Sigma-Aldrich）傳代一次。所有人細胞系均在5% O
為進行誘導，在5iLAF或4CL中補充10 nM LY（MedChem Express）和0.6 μM AS。
對於BPSC的自主分化
BPSC通過將BPSC接種於培養板中，並在不含誘導因子的TSM基礎培養基中培養2天獲得。
BPSC在含25 μg/mL FGF4和1 μg/mL肝素的TSM中分化3天后，收集CDX2-mCherry陽性或CDCP1（R&D Systems AF4515-SP）陽性細胞進行FACS分選。多向分裂細胞以TSM誘導2天后用於嵌合體實驗。
嵌合體通過將分化細胞和ESC顯微注射到正常供體8細胞期胚胎中構建。構建後的嵌合體在G-1 PLUS（Vitrolife 10128）培養基中培養，並於E3.5囊胚期移植入假孕2.5天受體子宮內。
2細胞期受體胚胎從交配後的ICR雌鼠輸卵管中收集，並在礦物油覆蓋條件下於37°C、5% CO條件下在G-1 PLUS培養基中培養。
將10–15個單細胞轉移至聚合板的凹孔中。將“四細胞期”四倍體胚胎的透明帶用20 mg/mL PE（Pronase E；Sigma，#P8811）消化，每組在一個凹孔中放置2枚胚胎。聚合胚胎在G-1 PLUS培養基中培養至囊胚期，隨後於假孕受體2.5 dpc時移植入子宮。
對於小干擾RNA（siRNA）轉染，首先將Lipofectamine RNAiMAX試劑（Invitrogen，貨號13778100）稀釋於Opti-MEM低血清培養基（GIBCO，貨號31985070）中。隨後，將稀釋後的試劑與分別用相同培養基稀釋的siRNA混合。該混合液在室溫下孵育15分鐘，以形成轉染複合物。孵育結束後，將轉染複合物逐滴加入細胞培養體系中。在該培養條件下繼續培養細胞48小時，以保證siRNA介導的基因敲低具有足夠的作用時間。48小時孵育結束後，收集細胞用於後續實驗檢測。
本研究中所使用的siRNA序列列於表S1。
我們構建了胚胎樣結構，所採用的IVC和EUCM培養體系遵循既往報道的方法。
首先，將起始細胞EPSC或ESC分為兩部分。其中一部分先轉化為BPSC，隨後轉入TSM中培養2天。另一部分在PrE誘導培養基中培養1天（EPSC）或2天（ESC）。隨後，將細胞消化為單細胞，並按每孔43,200個細胞的接種量鋪入AggreWell中（其中TS誘導細胞35,200個，PrE誘導細胞8,000個）。第1天，使用FM與N2B27基礎培養基按1:1配製的混合培養基，並加入10 μM Y27。次日，繼續使用不含Y27的新鮮混合培養基培養。第3天，每孔更換1.5 mL IVC2。
第4天，將所有聚集體轉移至超低吸附6孔板中，在搖床條件下（轉速70 rpm）繼續使用IVC2培養1天（每孔3 mL）。第5天，將形態良好的類胚體轉移至EUCM中，在靜置培養條件下培養1天。隨後3天，在滾瓶培養條件下培養類胚體（轉速30 rpm，Eastmo biotech Ltd，WEC001-GT4），每日更換新鮮EUCM，並在最後1天額外加入3 mg/L葡萄糖。
FM由DMEM組成，含15%（v/v）胎牛血清（FBS）、1 mM L-谷氨醯胺、1×非必需氨基酸、1×青黴素-鏈黴素和1×丙酮酸鈉。IVC2由CMRL 1066（Thermo Fisher Scientific，11530037）組成，含20%（v/v）FBS、1 mM丙酮酸鈉、1×青黴素-鏈黴素、2 mM L-谷氨醯胺、1× N2補充劑和0.25× B27補充劑。
EUCM由25%（v/v）DMEM（Sigma-Aldrich，D5671）或DMEM/F12（GIBCO，11330–032）、25%（v/v）成人人血（Sigma-Aldrich，H4522-100ML）、50%大鼠血清（Charles River）、1 mM丙酮酸鈉、1×非必需氨基酸、1×青黴素-鏈黴素和2 mM L-谷氨醯胺組成。
將6000–12000個細胞置於24孔Aggrewell-400（STEMCELL Technologies，34415）板的一個孔中，並使用blastoid培養基進行培養。
Blastoid培養基由25% TSC基礎培養基、25%（v/v）N2B27基礎培養基和50%（v/v）KSOM（艾貝生物，M1430）或G-1 PLUS組成，並補充2 µM ROCK抑制劑Y-27632（Selleck，S049）、12.5 ng/mL重組人FGF4、0.5 µg/mL肝素（Sigma-Aldrich，H3149）、3 µM CHIR99021、5 ng/mL重組人BMP4（PeproTech，12–05ET）以及0.5 µM A83–01（Axon Medchem，1421）。
次日將培養基更換為不含Y-27632的新鮮培養基。
在進行免疫熒光染色之前，所有細胞克隆和胚胎均需用4%多聚甲醛（Servicebio，中國）於4°C固定24 h。固定後，包括桑椹胚、囊胚和E6.5胚胎、細胞集落及E5.5樣胚狀體在內的樣品於室溫下用通透化試劑孵育30 min。通透化試劑由DPBS（Gibco）中的0.3% Triton X-100（Sigma-Aldrich，93443）配製而成。隨後，細胞集落於室溫下用含3%牛血清白蛋白（BSA，MP Biomedicals）的DPBS封閉液封閉1 h。
不同於細胞集落，胚胎和E5.5樣胚狀體需在室溫下使用含0.5% Triton X-100和3% BSA的DPBS進行通透和封閉2 h。一抗用封閉液稀釋後，與樣品於4°C孵育過夜。經含0.01% Triton X-100的DPBS洗滌3次後，二抗用3% BSA-DPBS稀釋，並於室溫下與樣品孵育2 h。細胞核使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Invitrogen，D3571）於室溫下染色15–20 min。細胞核染色後，使用DPBS洗滌樣品。
完成免疫熒光染色的樣品使用ZEISS LSM 880共聚焦顯微鏡進行拍攝和處理。
我們將胚樣體從羊膜中切出，置於4%多聚甲醛中，並於4°C過夜固定。在一抗孵育前，我們使用動物組織透明化試劑盒（Beyotime，P0112L）對胚樣體進行透明化處理。隨後，按照上述方法進行免疫熒光染色，並將二抗和DAPI的孵育時間加倍。完成免疫熒光染色的樣本使用Olympus FVMPE-RS顯微鏡進行拍攝和處理。
所用一抗及其稀釋比分別如下：小鼠抗CDX2（1:400；Bio-Genex，MU392A-UC）、抗OCT4（1:200；Santa Cruz，sc-5279）、抗GATA6（1:200；R&D Systems，AF1700）、抗SOX2（1:200；R&D Systems，AF2018-SP）、抗Brachyury（1:200；R&D Systems，AF2085-SP）、抗TFAP2C（1:200；Santa Cruz，sc-12762）、抗SOX17（1:200；R&D Systems，AF1924-SP）、抗SOX1（1:200；Cell Signaling Technology，4194S）、抗MHCII（1:200；R&D Systems，MAB4470-SP）、抗HOXB4（1:100；Abcam，ab133521）、抗TPBPA（1:500；Abcam，ab104401）。
二抗購自Thermo Fisher的Alexa Fluor®系列，稀釋比例為1:200。
細胞經0.05%胰蛋白酶-EDTA消化後，用補充2% FBS的DPBS清洗。使用抗CDCP1（1:50；R&D Systems，AF4515-SP）或抗PDGFRα（1:200；Abcam，ab203491）抗體染色後，細胞經清洗並重懸於補充2% FBS的DPBS中。
進行了高通量篩選，使用
經72小時孵育後，細胞用4%多聚甲醛（PFA）固定20 min，隨後用DAPI對細胞核進行染色。採用Operetta CLS系統（PerkinElmer，USA）進行高內涵成像，並使用Harmony 4.0軟件（PerkinElmer，USA）進行圖像分析。
將35 mm培養皿中匯合度達80%的細胞用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化。經DPBS清洗後，將細胞收集於含有1 mL TRIzol（Takara Bio，9109）的1.5 mL離心管中。渦旋振盪5 min後，細胞可轉移至−80 °C保存，直至提取RNA。採用酚-氯仿提取法提取總RNA。使用KAPA Stranded mRNA-Seq Kit（KAPA，KK8421）構建bulk mRNA-seq文庫。
構建完成的mRNA-seq文庫在Illumina Novaseq 6000平台上進行150 bp雙端測序。構建文庫的測序和質量控制由南京江北新區生物醫藥公共服務平台完成。
細胞經0.05%胰蛋白酶-EDTA消化後，用補充0.04% BSA的DPBS清洗3次。胚樣體使用accumax（Sigma-Aldrich，A7089-100ML）與膠原酶（Thermo Fisher Scientific，17104019）按1:1比例配製的混合液於室溫下消化10–20 min。用於scRNA-seq的樣本應滿足細胞活率大於80%、團聚率低於20%。
單細胞RNA文庫採用10× Genomics Chromium Next GEM Single Cell 3’ Kit v3.1（16 rxns，PN-1000268）和MGI DNBelab C RNA Library V2.0構建。文庫在Illumina Novaseq X Plus和MGI DNBSEQ-T7平台上進行測序。
對於bulk RNA-seq數據分析，我們使用軟件Trim Galore v0.6.10進行接頭去除。隨後，採用STAR 2.7.10b將數據比對至小鼠參考基因組mm10。基因表達矩陣使用FeatureCounts v2.0.3生成。差異表達基因的計算及主成分分析（PCA）使用DESeq2 v3.4.1軟件包完成。當 |log2（倍數變化）| > 0.5 且校正後 P < 0.05 時，基因被認為具有顯著性。對於GO分析，我們使用了Metascape（
為了獲得基因表達矩陣，使用CellRanger v7.1.0分析scRNA-seq FASTQ文件（
使用Cellranger ATAC v2.1.0分析scATAC-seq和FASTQ文件（
ChIP-seq分析按照標準流程進行
為了構建小鼠早期胚胎的發育軌跡，我們收集了bulk RNA-seq數據集GSE66582
本研究生成的bulk RNA-seq、ChIP-seq、單細胞RNA-seq和單細胞ATAC-seq數據可在國家基因組學數據中心Genome Sequence Archive取得（
本研究主要得到國家重點研發計劃（2021YFA1102900和2022YFC2702200）以及國家自然科學基金（32488101、32330030、82301921、32070823、92168205、32270909、82201881、92168205、31871448、31820103009、82022027、32300684和32400677）的資助。
本研究還得到上海市科學技術委員會重點項目（19JC1415300和21JC1405500）、上海市自然科學基金（21ZR1450700）、中國博士後科學基金（2023M732660、2023M732661）、中國博士後科學基金會博士後創新人才支援計劃（GZB20230523）、上海基礎研究先行區計劃、上海市博士後卓越計劃（2022521、2022551）、深圳醫學研究專項資金（B2402013）、中央高校基本科研業務費專項資金（項目編號：22120240435）、上海市高等學校高峰學科（IV類）以及教育部的支援。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.06.28.662107
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