近期生成的源自幹細胞的類囊胚能夠重現人類囊胚的結構與細胞組成，為闡明人類早期發育生物學提供了一種實驗模型。為了評估類囊胚在模擬人類囊胚方面的保真度，我們首先通過整合與整理單細胞轉錄組數據，建立了人類囊胚細胞身份與譜系分化的參考圖譜。
從囊胚形成到原腸胚形成階段的人類早期胚胎發生研究，一直受到與人類胚胎研究相關的技術挑戰和倫理問題的限制。
在此，我們致力於建立人類囊胚參考圖譜資源，並開發了一套計算流程，用於評估當前最先進方案所生成的類囊胚在重現人類囊胚特徵方面的質量。為此，我們通過整合圍植入期發育階段人類胚胎的單細胞轉錄組測序數據，構建了一個關於發育中人類囊胚細胞譜系與遺傳程序的綜合性細胞身份參考圖譜。
構建胚胎樣模型基準評價體系的第一步，是建立一套全面的人類胚胎細胞身份圖譜。為建立這一參考圖譜，我們開發了一條流程，通過迭代學習並整合多個人類胚胎單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據集。
為校正……時間進程中的變異性，
我們利用UMAP對迭代集成學習的結果進行了可視化，並通過目視確認在不同發育時間點上三大譜系的細胞類型得到了良好分離。
為進一步驗證我們的胚胎細胞身份參考圖譜，我們利用參考圖譜中大量的滋養外胚層細胞，解析支撐滋養外胚層發育的發育程序。
近年來，基於幹細胞構建的囊胚樣結構——類囊胚——的產生，為模擬人類早期發育開闢了新局面。
人類類囊胚生成方案彙總表。縮寫：人誘導多能幹細胞（hiPSC）、胚胎幹細胞（ESC）、擴展多能幹細胞（EPSC）、滋養外胚層（TE）、小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）、下胚層分化培養基（HDM）、滋養層分化培養基（TDM）。
為準確鑑定類囊胚的細胞狀態，我們利用胚胎參考圖譜和層級細胞類型分類方法scClassify，將類囊胚中的單細胞歸類為人類早期胚胎三大譜系之一（上胚層、下胚層或滋養層）。
我們的多尺度分類結果顯示，多數方案中均存在相當大比例的低置信度細胞；其中大多數方案（H/TDM、N2B和PALLY）僅顯示約40–55%的高置信度細胞，同時伴有相當比例的低置信度細胞。
我們從兩個指標來定義細胞類型覆蓋度：對三個譜系作出貢獻的能力，以及重現細胞狀態異質性的能力。我們測量了生成三個譜系的能力，其中每個譜系均包含五個或以上高置信度細胞。我們發現，除N2B類囊胚外，大多數類囊胚均能夠生成全部三個譜系（
接下來，我們定義了兩個用於測量細胞身份的指標：1）一個定量測量目標譜系與參考中對應譜系相似性的指標；2）一個測量某一譜系與其他譜系之間關係重現程度的指標（
與譜系特異性的細胞身份指標不同，後者用於量化胚胎參考中發現的某一給定細胞類型在類囊胚中被重現的程度；第二個指標則提供了關於某一細胞類型與另一細胞類型之間關係被捕捉得如何的資訊。我們將這一指標稱為“譜系間相似性”，以剖析胚胎參考中的譜系間結構在類囊胚中被模擬的程度（
由於與人類具有較近的系統發育關係並且相似，非人靈長類（NHP）是在取得人類胚胎材料受限情況下可用於胚胎研究的理想模型。因此，作為最終指標，我們評估了人類類囊胚是否表現出與非人靈長類胚胎譜系特徵的相似性。我們整合了兩種非人靈長類——食蟹猴和絨猴——的轉錄組學數據（
最後，我們總結了這四種人類類囊胚在這些基準評估指標上的結果（
儘管本研究的一項關鍵創新是生成
H.J.K.和P.Y.構思了該項目；H.J.K.構建了參考並在P.Y.和X.Z.的支援下開發了基準評估框架；H.J.K.在P.Y.、N.S.和H.H.的支援下分析了數據；H.J.K.和P.Y.撰寫了手稿。所有作者均審閱、編輯並批准了手稿的最終版本。
作者聲明不存在競爭性利益。
除非另有說明，scRNA-seq數據集的原始基因×細胞計數矩陣均從NCBI基因表達綜合數據庫（GEO）取得。所有數據集均與人類著床前及圍著床期囊胚或
我們使用
為了建立高質量的人類胚胎細胞身份參考，我們設計了一個框架，以協調不同研究生成的數據集中的細胞譜系和發育階段註釋，從而最大化由此產生的
對於細胞譜系註釋，我們通過利用三個具有預先註釋細胞譜系標籤的數據集（Petropoulos、Mole和Zhou1）生成初始參考，對未標註細胞進行了分類（
鑑於囊胚是在培養條件下獲得的，我們認為有必要進一步同步發育階段註釋
我們開發了一種方法，用於動態識別每個數據集在協調化及發育階段同步過程中所需的最佳迭代次數。由於某些數據集可能僅需對註釋進行最小程度的改進，而另一些數據集則可能需要多次迭代，直至集成學習帶來的收益趨於平台期，因此將最佳迭代次數定義為 scReClassify 概率開始趨於平台期時的拐點，這表明集成學習所帶來的收益增幅開始放緩。我們擬合了廣義加性模型（GAM）（
為了推導人類胚胎圖譜中的細胞身份基因統計量，使用 Cepo 軟件包（ 對標準化並經對數轉換的細胞×基因計數矩陣進行了分析
為了構建支撐滋養外胚層發育的基因調控網絡，我們首先依據發育進程將滋養外胚層樣本劃分為不同階段。為無偏識別不同的發育階段，我們利用 Cepo 推導的細胞類型特異性身份評分計算了差異性的累積和。通過比較相鄰兩個時間點之間差異性的變化，我們確定了三個不同階段，其中差異性總和的變化小於 0.1。基於細胞身份譜的層次聚類進一步證實了滋養外胚層樣本可分為這三個不同階段，我們將其定義為“早期”“中期”和“晚期”。
接下來，我們從胚胎參考數據中提取了被鑑定為與滋養外胚層身份及發育相關的基因，方法是根據每個滋養外胚層樣本的 Cepo 統計量選取排名前 20 的基因。利用這些基因，我們使用 igraph R 軟件包構建了一個基因調控網絡，其佈局通過 Fruchterman-Reingold 佈局算法計算得到（
本研究所評估的類囊胚方案的示意性總結亦見於
為了將單細胞轉錄組嵌入到共享潛在空間中，對於每個批次，首先將計數矩陣按總讀取數進行標準化，然後乘以 10,000 的縮放因子。隨後，通過方差穩定化轉換確定前 2,000 個高變基因，並根據其在所有 scRNA-seq 批次中的方差進行優先排序。接着，利用互逆主成分分析得到的 30 維嵌入，識別不同單細胞轉錄組批次之間細胞兩兩配對的錨點對應關係（
為了準確識別類囊胚中與人類早期胚胎相對應的細胞狀態，我們進行了多尺度分類，包括三個主要階段：（i）三大譜系的分類；（ii）高置信度細胞的識別與篩選；（iii）最後，根據其相對於人類胚胎的發育階段對細胞進行分類。
我們使用 scClassify 框架進行了細胞類型分類（
為推導人類胚泡樣體數據集中的細胞身份基因統計量，使用以下方法對細胞-基因變量的計數矩陣進行歸一化和對數轉換
為系統性比較不同生成胚泡樣體的方案在重現以下特徵方面的保真度
利用序列的累積和來確定拐點，我們將其定義為序列中首次出現兩個元素之差大於0.01的情況。
任何未通過該閾值的細胞均被視為低置信度，並從基準分析中排除。高置信度細胞的最終比例定義如下：
此前，我們已表明，基於Cepo統計量計算的細胞身份評分優於若干現有的標誌基因檢測工具，能夠在大規模圖譜數據中重建已知的層級譜系結構（
受限於猴數據的分辨率，我們比較了猴胚胎與胚泡樣體之間較寬泛譜系層面的細胞身份（即上胚層、下胚層和滋養層）。為比較細胞身份，我們再次遵循了（3）和（4）中的Cepo框架。具體而言，我們通過選取每個譜系和物種中排名前500的細胞身份基因來獲得非人靈長類細胞特徵。利用所選細胞身份基因集合的交集，我們計算了胚泡樣體與非人靈長類胚胎在各譜系中這些基因的Cepo統計量排序值之間的皮爾遜相關性（共165個基因）。總體評分通過對各譜系特異性評分取算術平均值得到。
較高的相關性表示與非人靈長類胚胎具有更高的相似性，而較低的相關性則表示相似性較弱。
為實現不同指標類別之間評分的可比性，我們首先通過z分數變換對各個指標評分進行歸一化，即通過平移和縮放使評分滿足σ = 1且μ = 0。隨後，我們進行了最小-最大標準化，將評分映射到[0,1]範圍內。為對各方案進行排序，我們通過取得每個指標下各方案的排名，並進一步計算不同指標間排名的算術平均值來彙總評分。最後，使用funkyheatmap軟件包對這些基準測試結果進行可視化，該軟件包可實現類似熱圖的基準數據可視化（
我們感謝兒童醫學研究所的同事們提出的建設性反饋。本研究得到澳大利亞國家衛生與醫學研究委員會（NHMRC）研究員基金（1173469）以及授予P.Y.的Metcalf Prize資助。
📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.07.11.603073
🏷️ 胚樣體模型 人類早期發育 單細胞轉錄組 參考圖譜 譜系分化 幹細胞