在小鼠胚胎發生過程中，上胚層與胚外內胚層之間的相互作用對於胚層命運決定和體軸發育至關重要。類原腸胚在缺乏來自胚外環境形態發生信號的情況下，能夠重現原腸胚形成的某些方面。這導致其主要表現為後部化和背側化表型，對胚胎譜系的代表性較為有限。本文中，我們開發並採用了一種共聚集（aggregoid）方法，將胚胎樣細胞與胚外內胚層樣細胞結合，以模擬發育中小鼠胚胎中的空間相互作用。
所得胚胎模型顯示出結和脊索的出現、富集的內胚層細胞群，以及增強的中胚層多樣性，包括心咽譜系和血管內皮，並總體呈現前部化和腹側化表型。該研究闡明瞭一種靈活的策略，用於優化基於幹細胞的胚胎模型，以獲得特定的形態類型。
小鼠三維類原腸胚是基於幹細胞的胚胎模型（SCBEMs）的一個子類，能夠重現胚胎發育的關鍵特徵：體軸的建立、三胚層（外胚層、中胚層和內胚層）的出現，以及早期器官發生的啟動。
與胚外內胚層（ExEnd）相對應的細胞類型，如原始內胚層（PrE）、髒壁內胚層（VE）和壁內胚層（PE），在小鼠早期胚胎發生中發揮多層面且動態的作用，它們支援上胚層成熟和體軸形成，同時提供結構支撐和營養運輸。
本文提出了一種靈活且模組化的共聚集策略，以提升SCBEM的複雜性，並闡明ExEnd對譜系決定、模式形成和形態發生的影響。我們開發了一個共聚集平台，將預先分化的ExEnd樣細胞類型（PrE樣、VE樣和AVE樣）與幼稚態小鼠胚胎幹細胞（mESCs）結合。我們發現，ExEnd細胞的存在能夠有利地調節NODAL和WNT信號傳導的平衡，從而增強細胞多樣性和結構形成。
與經典類原腸胚相比，所得aggregoid表現出原條、脊索樣結構以及總體增強的譜系代表性等特徵，包括內胚層譜系、軸向中胚層和心咽中胚層，並顯著增加腹側和前側細胞類型。此外，我們證明，特異性引入PrE樣、VE樣或AVE樣細胞能夠對譜系組成進行精細調控。總體而言，aggregoid策略的可重複性和靈活性使其成為一個可用於工程化調控mSCBEM組成及其發育潛能的平台。
為了生成包含胚外內胚層（ExEnd）區室的小鼠SCBEM，我們採用並調整了多種方案，以在不誘導轉基因過表達的情況下，由mESCs衍生出類似著床前和著床後ExEnd的細胞類型。先前的研究
Bulk RNA測序（RNA-Seq）表明，2i mESCs 具有初始型多能性（naïve pluripotency）的形態學和轉錄特徵，包括集落呈圓頂狀形態以及……的表達
向VE樣和AVE樣細胞分化伴隨着形態學變化：在NACLB處理開始後不久，細胞質中出現脂滴，以及XAL細胞中出現特徵性的形態改變，包括柱狀細胞和具有遷移表型的細胞（
為研究ExEnd樣細胞對小鼠SCBEMs早期圖式形成的影響，我們將2i細胞與三種預分化ExEnd樣細胞群中的任意一種在96孔U形底板中進行共聚集（
在CHIR脈衝處理之前，即聚集後48小時，在ExEnd聚集體和對照gastruloids中均檢測不到BRA-GFP表達（
至72小時，對照gastruloids中的BRA-GFP表達呈現徑向對稱分佈模式（
在72小時時間點，scRNA-seq顯示，在對照gastruloids中，僅有54%的細胞表達……
scRNA-seq數據進一步顯示，在72小時，對照以及RACL-、NACLB-和XAL-aggregoids中最主要的細胞類型均為尾側上胚層（caudal epiblast, CE）（
RACL-、NACLB-和XAL-aggregoids中PS樣和前部APS樣轉錄程序的啟用，並最終導致後部與前部細胞類型的共同出現，這一點還得到TGF-β相關基因上調的進一步支援，例如……
從72到96小時，對照gastruloids顯示出BRA-GFP結構域的逐步極化，其表達逐漸侷限於後半部，並隨後隨着伸長過程定位於後端尖部（
在72小時，CE簇中記錄到BRA的高表達，其特徵為表達……
接下來，我們對活體樣本進行即時成像，並對固定樣本進行免疫染色，以在空間上定位所鑑定的細胞群體。在96小時，BRA表達沿中線聚集，而在側方區域缺失（
在96小時，部分RACL-和NACLB-aggregoids顯示出一個明確的BRA、CDH1和FOXJ1（結節標誌物）表達結構域，該結構域被廣泛的SOX17陽性區域（類似內胚層）以及表達FOXF1和BRA的中胚層細胞所包圍（
結節（node）是軸向中胚層（脊索和前脊索板）的來源及其誘導性生態位。
通過表達諸如Sonic hedgehog之類的形態發生素
總之，我們的數據表明，通過誘導aggregoid中APS樣命運的出現，ExEnd樣細胞啟動了一系列發育過程，最終導致結節樣和脊索樣細胞的形成。
來源於FLK1（KDR）-GFP報告基因系的對照gastruloids
在96小時，對照gastruloids通常包含神經中胚層祖細胞（neuromesodermal progenitors, NMPs），這是一類共表達……的雙能細胞群體
中胚層譜系的多樣性在不同條件下存在顯著差異。在對照組 gastruloids 中，中胚層群體主要由軸旁中胚層衍生物構成（補充材料 7e, f）。相比之下，ExEnd-aggregoids 顯示出更廣泛的中胚層譜系譜，包括 IM 表徵增加，以及對應於側板中胚層（LPM）和軸性中胚層（脊索）的細胞類型出現，表明中胚層多樣性增加（補充材料 4b-d, 7e, f）。
scRNA-seq 進一步鑑定出一個對應於心咽中胚層的獨特細胞簇（補充材料 4b-d）。該細胞簇表達關鍵的心臟譜系基因，例如
這些結果表明，添加 ExEnd-like 細胞增強了 LPM 的發育，並在缺乏外源性心臟誘導刺激的情況下，顯著促進了 ExEnd-aggregoids 中心血管轉錄程序的出現。
在小鼠胚胎中，內胚層來源於兩種不同的起源：一種是植入前階段即已指定的早期胚外內胚層，稱為原始內胚層（PrE）；另一種是發育於原腸胚形成期間、來源於 APS 的確定性內胚層（DE）。
在 scRNA-seq 數據集中，我們在 RACL-、NACLB- 和 XAL-aggregoids 中檢測到了胚外內胚層細胞簇，在 48 至 120 小時的所有時間點均可見，但在對照 gastruloids 中未檢測到（
通常認為，gastruloids 形成 DE 的能力是有限且可變的，並且這種能力會因細胞系和培養條件的不同而表現出顯著變異。
為研究 ExEnd-like 細胞對 DE 形成的其他影響，我們選用了 BRA-GFP;SOX17-RFP mESC 細胞系，因為其在經典 gastruloids 中具有較強的內胚層生成能力。儘管在 120 小時的對照 gastruloids 中存在大量 SOX17 陽性細胞，確定性內胚層（DE）大多未能組織成連續的上皮管。相反，內胚層區室由一個較大的、位於後部且鄰近 BRA 的區域構成。
採用 BFP-ROSA26;FLK1-GFP 雙報告基因細胞系作為 RACL 細胞，並以 BRA-GFP;SOX17-RFP 雙報告基因細胞系作為 2i 細胞，對 72 至 120 小時進行比較性活細胞成像，揭示了 DE 動態過程中的差異。在對照 gastruloids 中，SOX17-RFP 表達通常在 88–96 小時之間啟動，出現在聚集體內部較深處、鄰近後部 BRA-GFP 區域的位置，並逐漸向前延伸（
我們的數據表明，當 ExEnd-like 細胞與 2i 細胞共同聚集時，能夠積極影響內胚層形成，產生來源於 2i 的結構，並表現出確定性內胚層特化的特徵。
Gastruloid 是一種胚胎發育的三維模型，通過聚集多能幹細胞並施加 CHIR 脈衝生成，以在缺乏傳統上被認為對胚胎中這些發育過程至關重要的胚外結構的情況下，模擬原腸胚形成這一複雜過程的關鍵特徵，如對稱性破缺、圖案形成和譜系分離。Gastruloid 兼具可重複性與模組化特性，因此非常適合用於有針對性地測試天然胚胎中特定特徵對胚胎發育的影響。
在本研究中，我們測試了三種來源於 2i mESCs 的不同胚外內胚層樣細胞群，作為上述所用 XEN 細胞的替代。為此，我們採用了已發表的、基於調控 WNT、Nodal 和 JAK/STAT3 信號通路的分化方案。
與 XEG 相比，ExEnd-aggregoid 並未表現出顯著的神經上皮表型。儘管 RACL、NACLB 和 XAL 細胞表達層粘連蛋白，但其內源性水平似乎不足以重現 XEG 模型中所觀察到的細胞外基質（ECM）效應。因此，儘管在 ExEnd-aggregoid 中出現了體節中胚層和類神經管細胞群，
在 aggregoid 中整合 ExEnd 樣細胞可有效促進早期前後軸（AP）模式化，導致早在 72 小時時即出現不對稱的 BRA 表達。從一開始，BRA 表達即侷限於後極，從而建立了一個界限清晰的 BRA 陰性前部區域。與 XEG 不同，該 BRA 陰性區域並不侷限於毗鄰胚外區室的一條狹窄條帶，而是延伸覆蓋了約二分之一至三分之一的 ExEnd-aggregoid，表明前部區域發生了擴展。
值得注意的是，BRA 的受限表達並未導致 SOX2 陽性前部神經結構的出現；相反，該區域呈現出 EOMES 陽性的前部原條樣特徵。在 84–96 小時期間，這一區域內又出現了一個額外的前部 BRA 表達域，提示其發生了動態重組，並可能存在類似於早期中內胚層形成的前部原條活動。這可能表明，ExEnd 樣細胞不僅在前部神經外胚層形成中發揮作用，還參與原條的構建，並促進 ExEnd-aggregoid 內細胞譜系的多樣性，這一點也得到了 scRNA-seq 分析的支援。
在本研究中，我們表明，與 ExEnd 樣細胞共聚集會使 NMP 命運向促中胚層偏向轉變，並導致中胚層細胞類型總體佔優勢。這可以通過 ExEnd 樣細胞中表達的 BMP（2/5/6/7）的促中胚層效應來解釋。
ExEnd-aggregoid 還表現出 Nodal 及其相關基因的上調，以及前部原條樣結構、結樣結構及其衍生物的出現；這些結構的特化依賴於 Nodal，例如脊索、前部中胚層和確定性內胚層。這種展開方式與近期研究結果一致，由
儘管具有良好的可重複性和廣泛的適用性，常規 gastruloid 普遍呈現後部化身份，以及內胚層、軸向中胚層和心血管衍生物代表性不足，仍然是其主要侷限性，這限制了其發育潛能以及其在研究胚胎發育某些方面時的適用性。其中部分譜系可通過添加外源性生長因子得到部分恢復——例如，在心臟發生條件下
本研究使用了以下小鼠胚胎幹細胞（mESC）系：R1（SCRC-1011，ATCC）、Flk1-eGFP（Jakobsson et al., 2010）、Rosa26-BFP/Flk1-GFP（未發表；由 Anna Bigas 實驗室提供）以及 Bra-GFP/Sox17-RFP（Pour et al., 2022）。mESC 在覆蓋有 0.1% 明膠溶液（ES-006-B，Merck）的 6 孔培養板上，使用 serum + LIF 培養基進行培養。
該培養基由 KnockOut DMEM（10829018，Gibco）補充 15% 胎牛血清（FBS；10309433，HyClone）、非必需氨基酸（NEAA；11140050，Gibco）、GlutaMAX（35050061，Gibco）、0.1 mM β-巰基乙醇（M3148，Merck）以及小鼠白血病抑制因子（LIF；ESG1107，Merck）組成。
對於 naïve 狀態轉換，將 mESC 接種於包被 0.01% 鳥氨酸（P3655，Merck）的孔中，並在 2i/N2B27+LIF 培養基中培養。
2i/N2B27+LIF 的組成如下：DMEM/F12（11330032 或 11039021，Gibco）與 Neurobasal 培養基（21103049 或 12348017，Gibco）按 1:1 混合，並補充 N2（17502048，Gibco）、B27（17504044，Gibco）、GlutaMAX（35050061，Gibco）、NEAA（11140050，Gibco）、丙酮酸鈉（11360039，Gibco）、β-巰基乙醇（M3148，Merck）、牛血清白蛋白（BSA；A8412，Merck）、LIF（ESG1107，Merck）、CHIR99021（3 µM；4423，Tocris）和 PD0325901（1 µM；4192，Tocris）。
在進行後續應用之前，細胞在 naïve 條件下維持 5–7 天。
所有細胞培養均在 37 °C、100% 濕度和 5% CO₂ 條件下進行。
在2i/N2B27+LIF培養基中培養5–7天的小鼠胚胎幹細胞（mESCs）使用Accutase（A6964，Merck）或TrypLE Express（12604013，Gibco）消化收集後，以1×10⁵ cells/cm²的密度重新接種於鋪有0.1%明膠的6孔板上。細胞接種於補充1×B-27 Supplement Minus Insulin（A1895601，Gibco）的RPMI 1640培養基（11875093，Gibco）中。
最初24小時後，將培養基更換為RACL培養基，其組成包括RPMI 1640（11875093，Gibco）、1×B-27 Supplement Minus Insulin（A1895601，Gibco）、100 ng/mL Activin A（Peprotech，120-14P）、3 μM CHIR99021（4423，Tocris Bioscience）以及小鼠LIF（ESG1107，Merck）。在該方案的第3至第4天之間對培養物傳代一次。
在RACL處理的第6–8天，細胞要麼在RACL條件下用於共聚集實驗，要麼進入進一步分化方案。
為啟動進一步分化，將RACL培養基更換為NACL培養基24小時。
NACL培養基由N2B27基礎培養基組成，後者由DMEM/F12（11320033，Gibco）與Neurobasal培養基（21103049，Gibco）按1:1混合配製，並補充N2 Supplement（17502048，Gibco）、B-27 Supplement（17504044，Gibco）、GlutaMAX（35050061，Gibco）、非必需氨基酸（11140050，Gibco）、丙酮酸鈉（11360039，Gibco）、β-巰基乙醇（M3148，Merck）和BSA（A8412，Merck），同時再補充100 ng/mL Activin A（Peprotech，120-14P）、3 μM CHIR99021（4423，Tocris Bioscience）以及小鼠LIF（ESG1107，Merck）。
為分化為內臟內胚層樣（VE-like）細胞，在NACL培養基中進一步補充50 ng/mL重組小鼠BMP4（Peprotech，315-27），稱為NACL+B。為生成前部內臟內胚層樣（AVE-like）細胞，先前維持於NACL中的細胞接受XAL培養基處理，該培養基由10 μM XAV939（S1180，Selleck Chemicals）、100 ng/mL Activin A（120-14P，Peprotech）和小鼠LIF（ESG1107，Merck）組成。
NACL+B和XAL兩種處理均持續三天。
類原腸胚按照既往建立的方案生成。
為生成aggregoid，在聚集步驟中將300個初始態mESCs與100個額外細胞（RACL、NACL+B或XAL條件所得）混合。細胞混合物在與上述類原腸胚形成相同的條件下接種。所有後續步驟，包括CHIR99021處理和每日更換培養基，均按照標準類原腸胚方案進行。對於“Minus Chir”實驗，在48小時向孔中加入Ndiff 227（Takara，Y40002）或自制N2B27。
總RNA使用RNeasy Micro Kit（Qiagen，74004）按照製造商說明，從細胞培養物或合併收集的類原腸胚中提取。每次提取收集48–96個類原腸胚或300,000–1,000,000個細胞，並在處理前儲存於–80 °C。RNA濃度使用Nanodrop分光光度計（ThermoFisher Scientific）進行定量。
採用 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（ThermoFisher Scientific，4368814）合成互補 DNA（cDNA）。定量即時 PCR（RT-qPCR）使用 ViiA 7 熱循環儀（ThermoFisher Scientific），並配合 TaqMan Gene Expression Master Mix 及基因特異性 TaqMan 探針（ThermoFisher Scientific）進行。引物詳細資訊見表 X。
每個 qPCR 反應包含 1 μL cDNA（稀釋至 20 ng/μL），總體積為 10 μL，在 386 孔板（Applied Biosystems，4309849）中進行。基因表達水平以管家基因 Gapdh（探針 ID：Mm01180221_g1，ThermoFisher Scientific，4331182）進行標準化，相對錶達量採用 2^–ΔΔCT 方法計算。技術重複數為 3，生物學重複數至少為 3。採用 2i/N2B27 細胞作為標準化的參考樣本。
總 RNA 共提取自 12 個小鼠細胞樣本：2i/N2B27 條件下的 naive mESCs，以及分化的胚外內胚層樣細胞類型：RACL、NACLB 和 XAL。取 2 μg 總 RNA，溶於 100 μL 無 RNA 酶水中，用於文庫製備。RNA 質量採用 Agilent Bioanalyzer 評估。
RNA-seq 文庫採用鏈特異性、poly(A) 富集方案進行製備，使用 TruSeq Stranded mRNA Library Prep（20020595，Illumina）和接頭 TruSeq RNA UD Indexes（貨號 2002237，Illumina）。測序在 Illumina NovaSeq X Plus 系統上使用 1.5B flow cells 進行，生成雙端 150 bp 讀長。
文庫經多重混樣後在兩個 lane 上測序，並在後續分析前合併來自兩個 lane 的 FASTQ 文件。測序儀器及軟件包括：NovaSeqXPlus System Suite v1.2.2.48004、BCL Convert v4.1.23、NSC scripts v1.0。
使用 BBDuk（BBMap toolkit）去除/修剪低質量 reads、接頭序列以及作為測序 spike-in 使用的 PhiX（10_bbduk 資料夾）。清潔並去除接頭後的 reads 使用 hisat2 比對至人類基因組/轉錄組（20_hisat2 資料夾）。使用 FeatureCounts 統計比對到基因上的 reads 數量（30_featureCounts 資料夾）。
修剪後的 reads 使用 HiSat2 v2.1.0 比對至小鼠基因組，並使用 RNA-strandness RF 參數以適配鏈特異性文庫製備。參考基因組和註釋文件來自 Ensembl release 113：基因組 FASTA：Mus_musculus.GRCm39.dna.toplevel.fa；基因註釋 GTF：Mus_musculus.GRCm39.113.gtf。比對後的文件使用 Samtools v1.2（配合 HTSlib v1.2.1）進行排序和建立索引。
基因水平定量採用 FeatureCounts v1.4.6-p1，並使用以下參數：FeatureCounts 輸出文件整理於 30_featureCounts 資料夾中，相關支援腳本和日誌文件存儲於對應的 *.sh 和 *.log 文件中。
來自 featureCounts 輸出的基因計數被導入 R（v4.5.1）並在所有樣本間進行合併。首先進行了初步質量檢查，以識別任何技術性離群值或異常情況。隨後，過濾掉在所有樣本中總計數少於 50 的基因，並確保這些基因至少在 8 個樣本中的 2 個樣本中表達。經質量控制後的計數矩陣使用 DESeqDataSetFromMatrix 函數導入 DESeq2（v1.48.1）。
隨後，我們應用方差穩定化轉換（Variance Stabilizing Transformation, VST）對計數進行標準化，用於主成分分析（PCA）和層次聚類，並識別主要基因。在所有條件組合之間鑑定差異表達基因；例如，2i vs RACL、2i vs NACL 等。針對每一組比較生成了火山圖和 MA 圖。隨後，我們使用 clusterProfiler（v4.16.0）對上調和下調基因進行了基因過度富集分析和通路分析。
對應於四種條件的 gastruloids——標準 gastruloid、RACL-aggregoids、NACLB-aggregoids、XAL-aggregoids——分別在 48 h、72 h、96 h 和 120 h 收集。對於每種條件：在 48 h 彙集 384 個 gastruloids，在 72 h 彙集 288 個 gastruloids，在 96 h 彙集 192 個 gastruloids，在 120 h 彙集 96 個 gastruloids。
為製備單細胞懸液，按照已發表方案（Bolondi et al., 2021）並結合我們的修改對 gastruloids 進行解離。將樣本收集後轉移至含有 200 µl TrypLE（12604013，Gibco）的培養皿中，於 37°C 孵育，並每 5 min 吹打一次，直至完全解離為單細胞懸液。隨後，使用 800 µl 冰冷的 PBS + 0.5% BSA（A8412，Merck）終止 TrypLE 反應。
經細胞過濾器（27215，Stemcell Technologies）過濾後，將細胞懸液於 4°C、300 rcf 離心 5 min。棄去上清後，用 1 ml PBS + 0.04% BSA 重懸細胞沉澱，並於 4°C、300 rcf 離心 5 min。重複清洗一次，最後將細胞沉澱重懸於 1 ml PBS + 0.04% BSA 中。通過台盼藍染色評估細胞活性。所有時期和條件下的死亡細胞比例均低於 5%。
隨後，使用 Chromium Next GEM Single Cell Fixed RNA Sample Preparation Kit, 16 rxns（1000414；10X Genomics）對細胞懸液進行固定，並在文庫製備前儲存於 -80°C 或 +4°C。固定和清洗後細胞數不少於 300,000 的樣本用於文庫構建。
樣本進行了多重混樣，並按照 Chromium Fixed RNA Kit（10x-1000496，10X Genomics）用戶指南，從每個樣本 10,000 個細胞構建 cDNA 文庫。測序前，使用 Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies）配合 Agilent BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit 對 cDNA 文庫進行質量控制和濃度測定。
單細胞 RNA 測序在 Norwegian Sequencing Centre 使用 NovaSeq 1 平台、1 個 lane、25B、300 cycles 完成。
測序數據採用 10x Genomic Cell Ranger（v8.0.1）流程比對至小鼠 mm10 參考基因組，並據此在計算機中對樣本進行拆分。隨後，樣本在同一流程中進行聚合，未進行標準化和批次校正；在適用情況下，也使用未聚合的數據。
由 CellRanger 流程（v8.0.1）生成的細胞條形碼矩陣使用 Seurat 軟件包（v5.3.0）載入 R（v4.5.1）中。第一輪質量控制要求細胞至少具有 200 個特徵且不超過 7500 個，UMI 計數介於 400 至 40000 之間。線粒體基因含量閾值設定為低於 25%。該線粒體基因含量截斷值通過數據驅動的方法確定。隨後，運行一個基礎的 Seurat 分析流程以識別聚類，主要依據 UMI 數量和特徵計數。接着進行第二輪質量控制，移除主要由低 UMI/特徵計數驅動的聚類。
我們使用 Seurat 的 FindMarker 函數驗證，被移除的低 UMI/特徵計數聚類僅由低計數所致，而非由具有生物學意義的信號驅動。隨後，使用 scDblFinder（v1.22.0）對細胞進行雙細胞評分。scDblFinder_score > 0.7 的細胞被排除在後續分析之外。
經質量控制後的細胞基於條件（所用培養基）和時間，採用 Seurat 基於 RPCA 的整合方法進行整合。該過程中使用了 5000 個整合特徵。通過從 Mouse gastruloid reference atlas 轉移標籤對細胞進行註釋。部分細胞類型被合併為標準標籤，以反映其生物學類型。
採用 EVOS M7000（Thermo Fisher Scientific）、IncuCyte S3（Sartorius）和 Nikon Crest Spinning disk（X-light V3 CREST）對細胞培養物和帶有熒光報告基因的 gastruloids 進行自動活細胞成像。
使用配備 Zyla sCMOS 相機、25 微米針孔盤以及 Nikon 20X/0.70 或 10X/0.40 空氣物鏡的 Andor Dragonfly Spinning Disk 共聚焦顯微鏡（Dragonfly）採集 gastruloids 和 RACL-aggregoids 的延時圖像。圖像每 15 分鐘採集一次，總時長為 24 小時。顯微鏡配備了 Okolab 的環境控制艙，可維持 5% CO₂。
類原腸胚和細胞培養物在室溫振盪平台上用4% PFA固定1小時，隨後用PBS清洗3次，並儲存在+4°C的PBS中。進行免疫染色時，樣本首先在封閉液中孵育：PBS（14190，Gibco）、10% BSA（422361V，VWR Life Science）、0.5% Triton x-100（M143，VWR Life Science）、0.02% SDS（L3771，Sigma），於室溫下孵育1小時，隨後與用封閉液稀釋的一抗在+4°C孵育過夜。
經一抗孵育後，類原腸胚在室溫下用封閉液清洗3次，每次30分鐘，然後與用封閉液稀釋的二抗在室溫下孵育3小時。經二抗孵育後，類原腸胚再用封閉液清洗3次，每次30分鐘。
所使用的一抗如下：小鼠抗-DKK1（1:100，Santa Cruz，sc-374574）、山羊抗-Brachyury（1:200，R&D Systems，AF2085）、大鼠抗-Eomesodermin（1:100，ThermoFisher，14-4875-82）、兔抗-FoxJ1（1:200，Abcam，ab235445）、小鼠抗-Dab2（1:200，Santa Cruz，sc-136964）、兔抗-FoxF1（1:200，Abcam，ab308633）、兔抗-FoxA2（1:200，Merck-Millipore，07-633）、兔抗-Otx2（1:200，ThermoFisher，13497-1-AP）、小鼠抗-Sox2（1:200，R&D Systems，MAB2018）、兔抗-FoxC1（1:200，Abcam，ab223850）、小鼠抗-心肌肌鈣蛋白T（1:200，ThermoFisher，MA5-12960）、小鼠抗-Tuj1（1:200，Abcam，ab78078）、山羊抗-E-cadherin（1:200，R&D Systems，AF748）、大鼠抗-PDGFRα（1:200，ThermoFisher，14-1401-82）、小鼠抗-GATA4（1:200，Santa Cruz，sc-25310）、兔抗-HNF4α（1:200，ThermoFisher，MA5-32295）、兔抗-Lefty（1:100，ThermoFisher，BS-11236R）。
細胞膜染色採用Wheat Germ Agglutinin（WGA）Alexa Fluor 647偶聯物（1:250，ThermoFisher，W32466）。肌動蛋白染色採用Phalloidin Alexa Fluor 488偶聯物（1:200，ThermoFisher，A12379）。
所使用的二抗如下：驢抗兔Cy3（1:500，Jackson ImmunoResearch，711-165-152）、驢抗兔AlexaFluor 647（1:500，Jackson ImmunoResearch，711-605-152）、驢抗小鼠Cy3（1:500，Jackson ImmunoResearch，715-165-150）、驢抗小鼠AlexaFluor 488（1:500，Jackson ImmunoResearch，715-545-150）、驢抗小鼠AlexaFluor 647（1:500，Jackson ImmunoResearch，715-605-150）、驢抗山羊Cy3（1:500，Jackson ImmunoResearch，705-165-003）、驢抗山羊AlexaFluor 488（1:500，Jackson ImmunoResearch，705-545-147）、驢抗山羊AlexaFluor 647（1:500，ThermoFisher，A32849）、驢抗大鼠Cy3（1:500，Jackson ImmunoResearch，712-165-153）、驢抗大鼠AlexaFluor 488（1:500，ThermoFisher，A48269）。
所有孵育和清洗步驟均在振盪條件下進行。染色完成後，將類原腸胚置於載玻片與蓋玻片之間，並用RapiClear溶液（152001，SunJin Lab）封片。樣品使用X Light V3 CREST共聚焦旋轉盤顯微鏡（Nikon）進行成像觀察。
圖像採用 Fiji（ImageJ）這一開源圖像分析軟件進行處理。
作者聲明不存在任何競爭性利益。
N.P.S. 和 S.V.P. 貢獻相同。N.P.S.、S.V.P. 和 S.K. 構思並設計了實驗；N.P.S.、S.V.P. 和 B.K.C. 開展了實驗；N.P.S.、S.V.P.、J.V.V.、T.M.L.A. 和 M.L. 對數據進行了分析與整理；T.M.L.A. 和 J.Ø. 執行了 scRNA-seq 分析；J.V.V. 和 E.M. 對稿件提出了關鍵性意見；N.P.S.、S.V.P. 和 S.K. 撰寫了稿件；S.K. 提供了經費支援。
本研究中使用的所有小鼠幹細胞系均來自既有資源庫。未使用新的實驗動物，因此根據《挪威科研動物使用條例》，無需倫理審批。
RACL-aggregoid 從 72 h 至 96 h 發育過程的延時熒光影像。圖像每 15 分鐘採集一次。胃胚樣體部分（2i 細胞）使用 BRA-GFP: SOX17-RFP 譜系，RACL 使用 BFP-ROSA26 細胞系。
a-d）整合 UMAP，分別表示對照胃胚樣體（a）、RACL-（b）、NACLB-（c）和 XAL-（d）聚集體中預測的細胞。
本項目獲得了奧斯陸大學、奧斯陸大學醫院、挪威研究理事會卓越中心計劃（資助編號 262613）、歐盟 H2020 Marie Skłodowska-Curie Actions / COFUND（資助編號 801133）以及歐洲創新委員會（EIC）（Horizon Europe）Pathfinder Challenge “Supervised Morphogenesis in Gastruloids”（資助編號 101071203）的經費支援。
我們感謝 Anna Bigas 和 Susanne van den Brink（西班牙巴塞羅那 Hospital del Mar 醫學研究所）提供 Rosa-BFP;Flk1-GFP mESC，感謝 Alexander Medvinsky（英國愛丁堡大學）提供 Flk1-GFP mESC，感謝 Iftach Nachman（以色列特拉維夫大學）提供 Bra-GFP;Sox17-RFP mESC。
我們還要感謝奧斯陸大學生物科學系 NorMIC 成像平台的 Xian Hu（Edna），感謝其提供幫助並開放旋轉盤顯微鏡用於胃胚樣體成像。
由於需要修正原始版本中的若干錯誤，稿件已進行了修訂： 1）修正了作者姓名和單位資訊中的錯誤。 2）修正了拼寫錯誤。 3）修正了圖號與正文之間的一致性問題。 4）使補充圖與正文內容保持一致。 5）更改了通訊作者。 6）修正了箭頭、標記和圖注說明。 7）更新了資助資訊。
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📄 原文連結：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.11.09.687163
🏷️ 小鼠胚胎模型 上胚層-胚外內胚層互作 類原腸胚 前腹側模式化 幹細胞胚胎模型